Giriş
Kolon kromatografisi, ince tabaka krom atografisinin (TLC) bir uzantısıdır. Okuyucunun laboratuvar uygulamalarında biraz deneyimi olduğu ve ince tabaka kromatografisi ile uğraştığı varsayılmaktadır. İnce bir silika veya alümina tabakası üzerine bir numune uygulamak yerine, numune bir adsorban silindiri üzerine bırakılır ve bileşenler silindirden tamamen boşalana kadar çözücü sürekli olarak basınçla uygulanır. Bu modifikasyon ile bileşenler sadece ayrılmakla kalmaz, aynı zamanda farklı kaplarda toplanarak karışımların saflaştırılmasına ve kirlilik içeren ilaçların ayrılmasına olanak sağlar. Kolon kromatografisi ("flaş kromatografi" olarak da bilinir), dergi makalelerinin prosedür bölümlerinde yaygın olarak görülmesinden de anlaşılacağı üzere araştırma ortamlarında sıklıkla kullanılmaktadır.
Prosedüreltartışma
İnce tabaka kromatografisinin (TLC) altında yatan aynı ilkeler kolon kromatografisi için de geçerlidir. Aslında, durumu değerlendirmek ve uygun çözücü oranını belirlemek için bir kolon gerçekleştirmeden önce her zaman bir TLC çalıştırılır. İyi bir ayırma elde etmek için, istenen bileşenin 0,35 civarında bir Rf değerine sahip olması (T LC konusunda Rf hakkında bilgi edinin) ve diğer bileşenlerden en az 0,2 Rf birimi ile ayrılması idealdir. Ayrılacak noktalar birbirine çok yakınsa (Rf farkı < 0,2 ise), noktaların ortasının 0,35 Rf değerine sahip olması en iyisidir. 0,35'e yakın bir Rf idealdir çünkü sabit-mobil faz dengelemesinin gerçekleşebileceği kadar yavaş, ancak difüzyondan kaynaklanan bant genişlemesini en aza indirecek kadar hızlıdır.
TLC için geçerli olmayan ancak kolon kromatografisinde bileşenlerin ayrılmasını etkileyen birkaç değişken vardır. Bunlar arasında kolon çapı, kullanılan adsorban miktarı ve çözücü akış hızı yer alır. Resim. 1'de numune boyutuna ve bileşenler arasındaki ayrım derecesine bağlı olarak değişken öneriler gösterilmektedir. Tüm senaryolarda, kolonlar 12,5-15 cm yükseklik arasında hazırlanmalıdır.
TLC için geçerli olmayan ancak kolon kromatografisinde bileşenlerin ayrılmasını etkileyen birkaç değişken vardır. Bunlar arasında kolon çapı, kullanılan adsorban miktarı ve çözücü akış hızı yer alır. Resim. 1'de numune boyutuna ve bileşenler arasındaki ayrım derecesine bağlı olarak değişken öneriler gösterilmektedir. Tüm senaryolarda, kolonlar 12,5-15 cm yükseklik arasında hazırlanmalıdır.
Örneğin, 2,5 cm'lik bir kolon, ayırma iyi ise (ΔRf > 0,2, Resim 1'deki üçüncü kolon) yaklaşık 400 mg veya ayırma zor ise (ΔRf > 0,1) yaklaşık 160 mg malzemeyi saflaştırabilmelidir. Kolon yaklaşık 200 ml çözücü kullanılarak hazırlanabilmeli ve elüe edilebilmelidir ve fraksiyonların her biri yaklaşık 10 ml çözelti ile toplanabilir.
Bir kolonun fiziksel olarak nasıl çalıştırılacağına dair çok sayıda varyasyon vardır. Yöntemlerdeki büyük farklardan biri kolonun nasıl hazırlandığıdır. "Kuru paketleme" yönteminde, kuru silika veya alümina doğrudan bir kolona eklenir ve çözücünün porsiyonlar halinde, daha sonra basınçla damlamasına izin verilir. "Islak paketleme" yönteminde, kolon önce çözücü ile doldurulur, ardından kuru silika veya alümina hafifçe çalkalanır ve ardından basınçla paketlenir. "Bulamaç" yönteminde, çözücü bir Erlenmeyer şişesindeki silika veya alüminaya eklenir, çamurumsu bir malzeme olarak kolona dökülür, ardından basınçla paketlenir (basınç şırınga ile üretilebilir).
Silika veya alüminaya çözücü eklendiğinde ısının açığa çıktığını bilmek önemlidir (ekzotermik bir çözünme ısısına sahiptirler). Bu bölümde bulamaç yöntemi sunulmaktadır, bunun ana nedeni bu ekzotermik adımın kolon yerine bir Erlenmeyer şişesinde gerçekleşmesine izin vermesidir. Kolonun paketlenmesi sırasında ısı açığa çıkarsa, çözücünün kaynamasından kaynaklanan kabarcıklar oluşabilir. Bunlar yeterince uzaklaştırılmazsa kolonun ayrılmasını engelleyebilir ve kolondaki adsorban malzemeyi çatlatabilir.
Bir kolonun fiziksel olarak nasıl çalıştırılacağına dair çok sayıda varyasyon vardır. Yöntemlerdeki büyük farklardan biri kolonun nasıl hazırlandığıdır. "Kuru paketleme" yönteminde, kuru silika veya alümina doğrudan bir kolona eklenir ve çözücünün porsiyonlar halinde, daha sonra basınçla damlamasına izin verilir. "Islak paketleme" yönteminde, kolon önce çözücü ile doldurulur, ardından kuru silika veya alümina hafifçe çalkalanır ve ardından basınçla paketlenir. "Bulamaç" yönteminde, çözücü bir Erlenmeyer şişesindeki silika veya alüminaya eklenir, çamurumsu bir malzeme olarak kolona dökülür, ardından basınçla paketlenir (basınç şırınga ile üretilebilir).
Silika veya alüminaya çözücü eklendiğinde ısının açığa çıktığını bilmek önemlidir (ekzotermik bir çözünme ısısına sahiptirler). Bu bölümde bulamaç yöntemi sunulmaktadır, bunun ana nedeni bu ekzotermik adımın kolon yerine bir Erlenmeyer şişesinde gerçekleşmesine izin vermesidir. Kolonun paketlenmesi sırasında ısı açığa çıkarsa, çözücünün kaynamasından kaynaklanan kabarcıklar oluşabilir. Bunlar yeterince uzaklaştırılmazsa kolonun ayrılmasını engelleyebilir ve kolondaki adsorban malzemeyi çatlatabilir.
Adım Adım Prosedürler
a) Ferrosen/asetilferrosen karışımının TLC'si, b) Kolon kromatografisi
Bu bölümde resmedilen kolon, ferrosen ve asetilferrosen karışımı içeren 0,20 g numunenin saflaştırılmasını göstermektedir (ham TLC Şekil 2 a'da verilmiştir). Kabaca 8 mL'lik fraksiyonlar küçük test tüplerine toplanmış ve yaklaşık 400 ml eluent kullanılmıştır.
a) Elüsyondan önce ham ferrosen/asetilferrosen karışımının TLC plakası, b) Elüsyondan sonra, c ) Fritli kolon, d ) Tabanına pamuk takılmış kolon, e) Pamuk takozu olmayan kolon (kullanmadan önce takılması gerekir)
Bir TLC çalıştırın
1) Kromatografi için uygun çözücüyü belirlemek üzere saflaştırılacak numune üzerinde bir TLC çalıştırın (Şekil 3 a ve b). İstenen bileşen 0,35 civarında bir Rf değerine sahip olmalı ve ideal olarak diğer tüm noktalardan en az 0,2 Rf birimi ile ayrılmalıdır.
2) Uygun Rf değerini veren bir eluent partisi hazırlayın. Hazırlanan miktar numune miktarına, kolonun boyutuna ve çözücü bileşiminin yarı yolda değiştirilmesinin planlanıp planlanmadığına bağlıdır. (Yönergeler için Şekil 1'e ve "çözücü gücü" eğilimleri için eluotropik seriye bakın).
2) Uygun Rf değerini veren bir eluent partisi hazırlayın. Hazırlanan miktar numune miktarına, kolonun boyutuna ve çözücü bileşiminin yarı yolda değiştirilmesinin planlanıp planlanmadığına bağlıdır. (Yönergeler için Şekil 1'e ve "çözücü gücü" eğilimleri için eluotropik seriye bakın).
Paketlenmiş kolonu hazırlayın
3) Uygun bir kolon edinin (bkz. Şekil 1) ve musluğun yakınında sıvının geçmesine izin verecek, ancak katı olmayacak bir şey olduğundan emin olun. Kolonlarda sinterlenmiş bir disk ("frit" olarak da bilinir) (Şekil 3 c) veya önceki kullanıcıdan kalan pamuk veya cam yününden bir tıkaç olabilir (Şekil 3 d). Disk veya tapa yoksa (Şekil 3 e), uzun bir çubuk kullanarak küçük bir pamuk veya cam yünü tomarını kolonun dibine sıkıştırın.
a) Çeker ocakta 12,5-15 cm yüksekliğe kadar silika dökülmesi, b ) Silika bir Erlenmeyer şişesine dökülmesi, c ve d) Bulamaç yapılması
Güvenlik notu: Toz silika ve alümina akciğer tahriş edicidir ve çeker ocakta her zaman dikkatli bir şekilde kullanılmalıdır. Dökülen toz, ıslak bir kağıt havlu ile silinerek bertaraf edilmelidir (ıslaksa, ince partiküller daha az dağılır).
5) Çeker ocakta, kolonda ölçülen adsorbanı bir Erlenmeyer şişesine dökün (Şekil 4 b), ardından bir miktar eluent ekleyin (Şekil 4 c). Tüm adsorban tamamen ıslanana, gaz kabarcıkları serbest kalana ve kıvam biraz kalın, ancak dökülebilir olana kadar cam bir karıştırma çubuğu ile döndürerek ve karıştırarak gevşek bir bulamaç yapın (Şekil 4 d).
a) Bulamacın kolona dökülmesi, b ) Şişenin durulanması, c ) Adsorbanın kolonun kenarlarına yapışması, d) Yapışan adsorbanın durulanması
6) Kelepçeli kolonun altına bir beher veya Erlenmeyer şişesi koyun ve musluğu açın. Hızlı bir hareketle, geniş ağızlı bir huni kullanarak silika veya alümina bulamacını döndürün ve kolona dökün (Şekil 5 a). Kalan bulamacı Erlenmeyer şişesinden (Şekil 5 b) ve kolondan durulamak için hemen daha fazla eluent kullanın.
7) Kolon haznesinin kenarlarındaki silika veya alüminayı eluent kullanarak ve bir Pasteur pipetiyle döndürerek hemen durulayın (Şekil 5 c ve d). Kurumasına izin verilirse, adsorban cama yapışacak ve kolayca durulanmayacaktır.
7) Kolon haznesinin kenarlarındaki silika veya alüminayı eluent kullanarak ve bir Pasteur pipetiyle döndürerek hemen durulayın (Şekil 5 c ve d). Kurumasına izin verilirse, adsorban cama yapışacak ve kolayca durulanmayacaktır.
a) Hava kabarcıklarını gidermek için kolonu itmek, b ) Hava basıncı uygulamak, c ) Kum eklemek, d ) Kumu yanlardan durulamak
8) Kolondaki hava kabarcıklarını (kolondaki adsorbanın zayıf ayrışmasına veya çatlamasına neden olabilir) çıkarmak ve adsorbanın eşit bir şekilde birikmesini sağlamak için bir mantar halka veya eklemlerinizi kullanarak kolonu sıkıca itin (Şekil 6 a).
9) Kolonun üst kısmına hafif bir hava basıncı uygulayarak (Şekil 6 b) sıkıştırın ve eluent seviyesi kolonun üst kısmından 1 cm uzakta olduğunda durun. Şekil 6 b'deki gibi hava hattıyla birlikte bir T-adaptörü kullanılıyorsa, hava akışının hassas kontrolü kauçuk boru üzerindeki sıkıştırma kelepçesinin ayarlanmasıyla gerçekleştirilebilir. Tüm elüsyon işlemi boyunca, beyaz adsorban kolonunu ıslak tutun ve eluent seviyesi silika veya alüminanın üst kısmının üzerinde olsun. Basınç uygulamasını durdurmak için contayı yavaşça kırın ve sıvının daha fazla damlamasını önlemek için musluğu kapatın.
10) Yaklaşık 0,5 cm yüksekliğinde ince bir kum tabakası (Şekil 6 c) ekleyin. Kumu camın kenarlarından çıkarmak için döndürme hareketi kullanarak kolonun kenarlarını eluent ile durulayın (Şekil 6 d). Musluğu açın ve sıvı kum tabakasının hemen üzerine gelene kadar sıvının damlamasına izin verin. Damlama çok yavaşsa hava basıncı uygulayın.
9) Kolonun üst kısmına hafif bir hava basıncı uygulayarak (Şekil 6 b) sıkıştırın ve eluent seviyesi kolonun üst kısmından 1 cm uzakta olduğunda durun. Şekil 6 b'deki gibi hava hattıyla birlikte bir T-adaptörü kullanılıyorsa, hava akışının hassas kontrolü kauçuk boru üzerindeki sıkıştırma kelepçesinin ayarlanmasıyla gerçekleştirilebilir. Tüm elüsyon işlemi boyunca, beyaz adsorban kolonunu ıslak tutun ve eluent seviyesi silika veya alüminanın üst kısmının üzerinde olsun. Basınç uygulamasını durdurmak için contayı yavaşça kırın ve sıvının daha fazla damlamasını önlemek için musluğu kapatın.
10) Yaklaşık 0,5 cm yüksekliğinde ince bir kum tabakası (Şekil 6 c) ekleyin. Kumu camın kenarlarından çıkarmak için döndürme hareketi kullanarak kolonun kenarlarını eluent ile durulayın (Şekil 6 d). Musluğu açın ve sıvı kum tabakasının hemen üzerine gelene kadar sıvının damlamasına izin verin. Damlama çok yavaşsa hava basıncı uygulayın.
Numuneyiekleyin
Numune kolona uygulandıktan sonra, difüzyon malzemeyi genişletmeye başlayacağından zamana karşı bir yarış söz konusudur. Kolonu hemen ve bütünüyle tamamlamaya hazır olana kadar numune uygulanmamalıdır. Bu işlem 15 ila 90 dakika arasında sürebilir! Fraksiyonları toplamak için test tüpleri kullanılıyorsa, numuneyi eklemeden önce test tüpleri bir rafta düzenlenmeli ve kolon yüksekliği test tüpü rafının altına kayabilecek şekilde ayarlanmalıdır.
a) Bir katının az miktarda diklorometan ile çözülmesi, b ) Numunenin uygulanması, c ) Numunenin şişesinde durulanması, d ) Numuneyi kum tabakasının hemen yanından kolona itmek için basınç uygulanması
11) Ham numune sıvı ise, doğrudan kullanın (13. adıma geçin).
12) Ham numune bir katıysa, aşağıdakilerden birini yapın.
12) Ham numune bir katıysa, aşağıdakilerden birini yapın.
a) İdeal durum: katıyı minimum miktarda eluent içinde çözün (en fazla birkaç ml).
b) Katı özellikle çözünür değilse veya birkaç ml eluent içinde çözünmüyorsa, minimum miktarda diklorometan içinde çözün (en fazla birkaç ml, Şekil 7 a).
c) Eğer katı eluentte çözünmüyorsa, alternatif bir prosedür de mümkündür. Birkaç ml düşük kaynama noktalı çözücü (örn. diklorometan veya aseton) kullanarak katıyı yuvarlak tabanlı bir şişede çözün. Şişeye yaklaşık 1 g silika veya alümina ekleyin, ardından adsorban üzerinde biriken numuneyi içeren bir katı bırakmak için döner buharlaştırıcıdaki çözücüyü çıkarın. Paketlenmiş kolonun üzerinde bir inç eluent dururken (bu yöntem kullanılıyorsa kum katmanını eklemeyi atlayın), geniş ağızlı bir huni kullanarak silika adsorbe edilmiş numuneyi kolonun üzerine dökün. Cama toz yapışırsa, daha fazla eluent ile durulayın (adım 15 ile devam edin).
13) Numuneyi pipet aracılığıyla dikkatlice kolona ekleyin, sıvıyı veya çözeltiyi pipet ucuyla doğrudan kumun üzerine damlatın, kenarlardan aşağıya değil (Şekil 7 b). Sıvıyı kumda veya silika/alümina kolonda çentiklere neden olacak şekilde zorla fışkırtmamaya dikkat edin.
14) Numune kabını biraz çözücü (veya kullanılıyorsa diklorometan, Şekil 7 c) ile durulayın ve aynı pipeti kullanarak durulama suyunu kolona ekleyin (pipeti de durulamak için).
15) Musluğu açın ve numune kum tabakasını (Şekil 7 d) geçip kolonun beyaz alanına girene kadar sıvının damlamasına izin verin (bu işlem 20 saniyeden fazla sürerse hava basıncı uygulayın).
16) Sıçrayan numuneyi durulamak için 1-2 pipet dolusu eluent kullanarak kolonun kenarlarını döndürme hareketiyle nazikçe durulayın. Yine, numune beyaz adsorbanın içine itilene kadar sıvının damlamasına izin verin (veya hava basıncı uygulayın).
Tüm numunenin adsorban üzerinde biriktiğinden emin olana kadar durulama adımını tekrarlayın. Kum tabakasında hala bir miktar numune bulunuyorsa, daha fazla çözücü eklendiğinde eluent içinde çözünerek verim kaybına yol açabilir. Bileşik renkliyse, durulama tamamen berrak olmalıdır.
14) Numune kabını biraz çözücü (veya kullanılıyorsa diklorometan, Şekil 7 c) ile durulayın ve aynı pipeti kullanarak durulama suyunu kolona ekleyin (pipeti de durulamak için).
15) Musluğu açın ve numune kum tabakasını (Şekil 7 d) geçip kolonun beyaz alanına girene kadar sıvının damlamasına izin verin (bu işlem 20 saniyeden fazla sürerse hava basıncı uygulayın).
16) Sıçrayan numuneyi durulamak için 1-2 pipet dolusu eluent kullanarak kolonun kenarlarını döndürme hareketiyle nazikçe durulayın. Yine, numune beyaz adsorbanın içine itilene kadar sıvının damlamasına izin verin (veya hava basıncı uygulayın).
Tüm numunenin adsorban üzerinde biriktiğinden emin olana kadar durulama adımını tekrarlayın. Kum tabakasında hala bir miktar numune bulunuyorsa, daha fazla çözücü eklendiğinde eluent içinde çözünerek verim kaybına yol açabilir. Bileşik renkliyse, durulama tamamen berrak olmalıdır.
a ve b) Çözücü haznesinin doldurulması, c ve d) Kolonun elüe edilmesi
Eluent ile Doldurun ve Kolonu Elute Edin
17) Pipetle (Şekil 8 a) dikkatlice daha fazla eluent ekleyin, kenarlardan aşağı doğru döndürün ve ardından kum tabakası eklemelerle artık rahatsız edilmeyecek hale geldiğinde, hazneyi doldurmak için hazırlanan eluentten daha büyük miktarlarda (Şekil 8 b) dikkatlice dökün (veya ihtiyaç duyulabilecek kadar doldurun). Kolonun paketlenmesi sırasında toplanan temiz eluent yeniden kullanılabilir.
18) Numuneyi kolondan nazikçe ve düzenli bir şekilde elüe etmek için hava basıncı kullanın (Şekil 8 c ve d). Basınç ne kadar çok kez başlatılır ve durdurulursa, kolonun çatlama olasılığı o kadar artar. Basıncın tüm süre boyunca nazik ve sabit tutulması en iyisidir.
Elüsyon sırasında en uygun damlama hızı kolonun boyutuna bağlıdır. İdeal eluent akışı, adsorbanın üzerindeki kolonun silindirik bölümündeki solventin dakikada 5 cm düşmesidir. Bu nedenle, damlama hızı daha geniş bir kolona kıyasla dar bir kolonda daha yavaş olmalıdır. Bir inçlik bir kolon için damlama hızı, tek tek damlaların zar zor ayırt edilebildiği yerde olmalıdır. Bu boyutta bir kolonla musluktan akan bir sıvı akışı biraz fazla hızlıdır.
18) Numuneyi kolondan nazikçe ve düzenli bir şekilde elüe etmek için hava basıncı kullanın (Şekil 8 c ve d). Basınç ne kadar çok kez başlatılır ve durdurulursa, kolonun çatlama olasılığı o kadar artar. Basıncın tüm süre boyunca nazik ve sabit tutulması en iyisidir.
Elüsyon sırasında en uygun damlama hızı kolonun boyutuna bağlıdır. İdeal eluent akışı, adsorbanın üzerindeki kolonun silindirik bölümündeki solventin dakikada 5 cm düşmesidir. Bu nedenle, damlama hızı daha geniş bir kolona kıyasla dar bir kolonda daha yavaş olmalıdır. Bir inçlik bir kolon için damlama hızı, tek tek damlaların zar zor ayırt edilebildiği yerde olmalıdır. Bu boyutta bir kolonla musluktan akan bir sıvı akışı biraz fazla hızlıdır.
a-c) Fraksiyonların toplanması, d) Bir kolonun çalıştırılması
Kesirleri toplayın
19) Elüsyon sıvısını hemen bir raf üzerindeki test tüplerine toplamaya başlayın (Şekil 9 a). Her bir test tüpünde toplanacak hacimlerle ilgili öneriler için Şekil 1'e bakın.20) İlk test tüpü dolduğunda veya eğitmeninizin önerdiği şekilde veya Şekil 1'de belirtildiği gibi belirli bir yükseklikte sıvı toplandığında, rafı hareket ettirerek farklı bir tüpe toplamaya başlayın (Şekil 9 b ve c). Tüpleri raf üzerinde sırayla doldurun ve saklayın.
Bu farklı tüplere "fraksiyon" adı verilir. Bir kolonun amacı, çoğu (veya bazı) fraksiyonların saf malzeme içereceği kadar küçük fraksiyonlar toplamaktır. Karışımın ayrılması zorsa (bileşenlerin ΔRf'si düşükse), küçük fraksiyonlar (örneğin yarı dolu tüpler) toplamak en iyisi olabilir.
Bu farklı tüplere "fraksiyon" adı verilir. Bir kolonun amacı, çoğu (veya bazı) fraksiyonların saf malzeme içereceği kadar küçük fraksiyonlar toplamaktır. Karışımın ayrılması zorsa (bileşenlerin ΔRf'si düşükse), küçük fraksiyonlar (örneğin yarı dolu tüpler) toplamak en iyisi olabilir.
a-c) Kolonun ucuna sıçrayan durulama malzemesi, d) Kolonu çalıştıran öğrenciler
21) Sıvı kolondan akarken, genellikle kolon ucunun dış taraflarına sıçrar ve çözücü buharlaştığında uçta bir malzeme halkası görebilirsiniz (bileşen Şekil 10 b'deki gibi katı ise bir katı halkası veya bileşen sıvı ise yağlı damlacıklar göreceksiniz). Bileşenler renkliyse, bir bileşen tamamen elüe olmuş gibi göründüğünde ve diğer bileşen yaklaşmadan önce kolon ucu durulanmalıdır (Şekil 10 c).
22) Periyodik olarak eluent seviyesine dikkat edin ve kum tabakasının altına düşmeden önce yeniden doldurun.
22) Periyodik olarak eluent seviyesine dikkat edin ve kum tabakasının altına düşmeden önce yeniden doldurun.
a) Elüsyon, b ) Çözücü polaritesini artırmak için etil asetat eklenmesi, c) Çözücü seviyesinin kum tabakasına yaklaşması, d) Yeniden doldurma
Muhtemelen Çözücü Polaritesini Artırın
23) Özellikle ayrılacak bileşenler benzer Rf değerlerine sahipse, tüm kolon boyunca tek bir eluent kullanılabilir. Ancak, bileşenler çok farklı Rf değerlerine sahipse, bir bileşen kolondan elüe edildikten sonra çözücü polaritesi artırılabilir (Şekil 11 a).
Çözücü polaritesinin artırılması bileşenlerin "daha hızlı" hareket etmesini sağlayacaktır. Daha hızlı bir elüsyonun istenmesinin birkaç nedeni vardır. İlk olarak, bir bileşen kolondan zaten çıkmışsa, kolon ayırma işini zaten yapmıştır, bu nedenle işlemi hızlandırmak toplanan fraksiyonların saflığını etkilemeyecektir. İkincisi, bir kolonu çalıştırmak ne kadar uzun sürerse, bileşen bantları o kadar geniş olacaktır (difüzyon nedeniyle) ve geniş bir malzeme bandı toplamak çok fazla çözücü kullanacaktır (ve israf edecektir).
Çözücü polaritesinin artırılması bileşenlerin "daha hızlı" hareket etmesini sağlayacaktır. Daha hızlı bir elüsyonun istenmesinin birkaç nedeni vardır. İlk olarak, bir bileşen kolondan zaten çıkmışsa, kolon ayırma işini zaten yapmıştır, bu nedenle işlemi hızlandırmak toplanan fraksiyonların saflığını etkilemeyecektir. İkincisi, bir kolonu çalıştırmak ne kadar uzun sürerse, bileşen bantları o kadar geniş olacaktır (difüzyon nedeniyle) ve geniş bir malzeme bandı toplamak çok fazla çözücü kullanacaktır (ve israf edecektir).
Normal faz kromatografisinde "çözücü güçlerine" göre sıralanmış yaygın çözücülerin bir listesi olan eluotropik serilerin kısmi bir listesini içerir. Daha polar çözücü Rf'de en dramatik artışa neden olur
24) Çözücü polaritesini artırmak için, polar çözücü doğrudan kolon rezervuarındaki eluentin içine damlatılabilir (Şekil 11 b). Örneğin, bir hekzan:etil asetat karışımı kullanılıyorsa, rezervuardaki eluente saf etil asetat eklenmesi polaritesini artıracaktır. Elüent seviyesi azalıyorsa, daha polar bileşenin daha yüksek bir yüzdesini içeren bir çözelti hazırlanabilir. Örneğin, kolonda ilk olarak 4:1 hekzan:etil asetat karışımı kullanılmışsa, 1:1 karışım kullanmak daha polar bir çözücü olacaktır.
25) Kolonu daha önce olduğu gibi daha polar çözücü ile elute edin ve her zaman eluent seviyesini izlemeyi ve kum tabakasının altına düşmeden önce yeniden doldurmayı unutmayın (Şekil 11 d).
26) Çözücü polaritesini artırmak için polar çözücü doğrudan kolon haznesindeki eluentin içine damlatılabilir (Şekil 11 b). Örneğin, bir hekzan:etil asetat karışımı kullanılıyorsa, rezervuardaki eluente saf etil asetat eklenmesi polaritesini artıracaktır. Elüent seviyesi azalıyorsa, daha polar bileşenin daha yüksek bir yüzdesini içeren bir çözelti hazırlanabilir. Örneğin, kolonda ilk olarak 4:1 hekzan:etil asetat karışımı kullanılmışsa, 1:1 karışım kullanmak daha polar bir çözücü olacaktır.
27) Kolonu daha önce olduğu gibi daha polar çözücü ile elüe edin ve her zaman elüent seviyesini izlemeyi ve kum tabakasının altına düşmeden önce yeniden doldurmayı unutmayın (Şekil 11 d).
25) Kolonu daha önce olduğu gibi daha polar çözücü ile elute edin ve her zaman eluent seviyesini izlemeyi ve kum tabakasının altına düşmeden önce yeniden doldurmayı unutmayın (Şekil 11 d).
26) Çözücü polaritesini artırmak için polar çözücü doğrudan kolon haznesindeki eluentin içine damlatılabilir (Şekil 11 b). Örneğin, bir hekzan:etil asetat karışımı kullanılıyorsa, rezervuardaki eluente saf etil asetat eklenmesi polaritesini artıracaktır. Elüent seviyesi azalıyorsa, daha polar bileşenin daha yüksek bir yüzdesini içeren bir çözelti hazırlanabilir. Örneğin, kolonda ilk olarak 4:1 hekzan:etil asetat karışımı kullanılmışsa, 1:1 karışım kullanmak daha polar bir çözücü olacaktır.
27) Kolonu daha önce olduğu gibi daha polar çözücü ile elüe edin ve her zaman elüent seviyesini izlemeyi ve kum tabakasının altına düşmeden önce yeniden doldurmayı unutmayın (Şekil 11 d).
a) Orijinal TLC plakası, b ) Kolon tarafından toplanan fraksiyonlar, c ) Fraksiyonların TLC plakası üzerine lekelenmesi, d) Her fraksiyonun örneklerinin görselleştirilmiş TLC plakası
İstenen Bileşeni Bulun ve Yoğunlaştırın
28) Test tüpü fraksiyonlarında istenen bileşeni bulurken, kolon kromatografisinde Rf ve elüsyon sırası arasındaki ilişkiyi anlamak faydalı olacaktır.Kolon kromatografisinde numune kolonun önünde biriktirilir ve aşağıya doğru elüe edilirken, ince tabaka kromatografisinde numune plakanın alt kısmında lekelenir ve yukarıya doğru elüe edilir. Bu nedenle, bir kolon ters çevrilmiş bir TLC plakası gibi düşünülebilir. Daha yüksek Rf değerine sahip bir bileşik "daha hızlı" çalışır, yani TLC plakasında daha üstte yer alır ve bir kolon ile önce toplanır. Bu bölümde resmedilen kolonda, daha düşük Rf değerine sahip bileşen (Şekil 13 a'daki TLC plakasında turuncu), kolondan ikinci olarak toplanan bileşendir.
29) Önce hangi test tüplerinin çözünmüş bileşik içerdiğini belirleyin.
29) Önce hangi test tüplerinin çözünmüş bileşik içerdiğini belirleyin.
a) Her fraksiyondan bir örneği, toplandıkları sıraya karşılık gelen fraksiyon numaraları ile etiketlenmiş bir TLC plakasına koyun (Şekil 13 c). Fraksiyonların seyreltik olması ihtimaline karşı her bir numuneyi 2-3 kez üst üste koymak en iyisi olabilir.
b) Çok sayıda fraksiyon toplandıysa ve her fraksiyondan örnek almakta tereddüt ediyorsanız, bileşik içerebilecek renksiz fraksiyonları belirlemenin bir yöntemi de test tüplerini yönlendiren bir kalıntı ipucu aramaktır. Buharlaşmadan sonra, bazen test tüpünün üstünde katı bir kalıntı (Şekil 13) veya yağlı damlacıklar kalır, bu da bu fraksiyonların çözücüden daha fazlasını içerdiğini açıkça gösterir. Görünür kalıntı içeren tüplerin yakınındaki tüm fraksiyonlardan numune alın.
Şekil
c) Hangi fraksiyonların bileşik içerdiğini belirlemek için UV ışığı ve/veya bir boya kullanarak benekli TLC plakasını görselleştirin (Şekil 13 d)
c) Hangi fraksiyonların bileşik içerdiğini belirlemek için UV ışığı ve/veya bir boya kullanarak benekli TLC plakasını görselleştirin (Şekil 13 d)
a ) Olası bileşik içeren fraksiyonların elüe edilmiş TLC plakaları, b ) Fraksiyonların birleştirilmesi, c) Bir fraksiyon tüpünün durulanması
28) Bileşik içeren tüm fraksiyonların TLC'sini çalıştırın ve 2,5 cm genişliğindeki TLC plakası başına beş örneğe kadar lekeleme yapın. Varsa bu amaç için daha geniş TLC plakaları kullanılabilir.
29) Orijinal ham TLC plakası ile karşılaştırarak istenen Rf değerine sahip bileşiği tanımlayın. Elüe edilen TLC plakasında görüldüğü gibi, istenen bileşiği saf halde içeren fraksiyonları tutmayı seçin. Örneğin, Şekil 15 a'da daha yüksek Rf'ye sahip bileşik isteniyorsa, 6-10 fraksiyonları tutulmalıdır.
30) Saf fraksiyonları uygun büyüklükte yuvarlak tabanlı bir şişede birleştirin (en fazla yarısı dolu, Şekil 15 b). Her bir test tüpünü az miktarda eluent (veya çözünürlük bir sorunsa başka bir çözücü) ile durulayın ve durulama suyunu yuvarlak tabanlı şişeye ekleyin (Şekil 15 c).
31) Saflaştırılmış bileşiği şişede bırakmak için çözücüyü döner buharlaştırıcıda buharlaştırın.
29) Orijinal ham TLC plakası ile karşılaştırarak istenen Rf değerine sahip bileşiği tanımlayın. Elüe edilen TLC plakasında görüldüğü gibi, istenen bileşiği saf halde içeren fraksiyonları tutmayı seçin. Örneğin, Şekil 15 a'da daha yüksek Rf'ye sahip bileşik isteniyorsa, 6-10 fraksiyonları tutulmalıdır.
30) Saf fraksiyonları uygun büyüklükte yuvarlak tabanlı bir şişede birleştirin (en fazla yarısı dolu, Şekil 15 b). Her bir test tüpünü az miktarda eluent (veya çözünürlük bir sorunsa başka bir çözücü) ile durulayın ve durulama suyunu yuvarlak tabanlı şişeye ekleyin (Şekil 15 c).
31) Saflaştırılmış bileşiği şişede bırakmak için çözücüyü döner buharlaştırıcıda buharlaştırın.
a) Kolonu kurutmak için hava basıncı kullanmak, b ) Kolonun baş aşağı kurumasına izin vermek, c) Atık silikayı toplamak
Sütunu Temizleyin
32) Kolonu kurutmak için, eluentin büyük kısmını kolondan bir atık kabına boşaltmak üzere hava basıncı uygulayın. Daha sonra aşağıdaki yöntemlerden birini kullanarak kolonu kurutun.
a) Diğer şeyleri temizlerken daha fazla kurutmak için kolondan hafif bir hava akımı geçirin (Şekil 16 a).
b) Kolonu çeker ocaktaki büyük bir atık beherinin üzerine baş aşağı kelepçeleyin, böylece adsorban kuruduktan sonra düşecektir (Şekil 16 b). Bu uzun zaman alacaktır (bir sonraki ders saatine kadar), ancak bir seçenektir.
33) Kuruduğunda, adsorban kolondan çeker ocaktaki bir atık kabına dökülebilir (Şekil 16 c).
Güvenlik notu: Toz adsorbanlar akciğerleri tahriş eder ve kolon akciğerlerinize ulaşabilecek artık bileşikler içeriyorsa tehlikeleri daha da artar. Silika veya alümina tozlarının dökülmesi her zaman çeker ocakta yapılmalıdır.
34) Adsorbanın büyük kısmı bir atık kabında toplandığında, kalan katı maddeleri lavaboda durulamak için su kullanın ve ardından kolonu asetonla atık bir beherde durulayın. Ayrıca, kolonu sabun ve suyla temizleyin ve musluk parçaları ayrı olacak şekilde kurulayın.
Güvenlik notu: Toz adsorbanlar akciğerleri tahriş eder ve kolon akciğerlerinize ulaşabilecek artık bileşikler içeriyorsa tehlikeleri daha da artar. Silika veya alümina tozlarının dökülmesi her zaman çeker ocakta yapılmalıdır.
34) Adsorbanın büyük kısmı bir atık kabında toplandığında, kalan katı maddeleri lavaboda durulamak için su kullanın ve ardından kolonu asetonla atık bir beherde durulayın. Ayrıca, kolonu sabun ve suyla temizleyin ve musluk parçaları ayrı olacak şekilde kurulayın.
Sorun Giderme
Kolonda Hava Kabarcıkları görülüyor
Hava kabarcığı, sabit-hareketli faz dengelenmesinin gerçekleşmediği boş bir ceptir, bu nedenle bileşenler hava kabarcığı etrafında olması gerekenden daha hızlı hareket eder. Bu, karışımın ayrılması zorsa (bileşenler Şekil 17'de olduğu gibi çok yakın Rf değerlerine sahipse) çakışmaya neden olabilecek düzensiz elüe bantlarına yol açabilir.
Şekil
Kolonda hava kabarcıkları görülüyorsa ve kum veya numune henüz uygulanmamışsa, tüm hava kabarcıklarını gidermek için paketleme sırasında kolonu iyice itin. Kabarcıklar yerinden oynamıyorsa eğitmeninizle görüşün, çünkü göreve çok hassas yaklaşıyor olabilirsiniz. Kum veya numune zaten uygulanmışsa, kolonu olduğu gibi bırakmak ve hava kabarcıklarının ayırmayı etkilememesini ummak en iyisidir.
Bantlar eşit olmayan şekilde elüe oluyor
Bir karışımın bileşenleri renkliyse, bantlar eğri bir şekilde elüe olduğunda belirgin olabilir. Bu büyük olasılıkla kolonun hafif bir diyagonalde sıkıştırılmasından kaynaklanmaktadır. Kolon eğimli bir şekilde kenetlenirse, bileşenler eğimli bir şekilde hareket edecektir (Şekil 18). Bileşenler benzer bir Rf değerine sahipse bu durum ayırma sorunlarına neden olabilir.
Şekil
Bu sorunu bir kolonun ortasında çözmenin bir yolu yoktur, ancak bileşenler çok farklı Rf değerlerine sahipse, eğimli bantların ayırma üzerinde hiçbir etkisi olmayabilir. Gelecekte, kolonun hem yan yana hem de ön-arka yönlerde tamamen dikey olduğunu kontrol ettiğinizden emin olun.
Last edited by a moderator:
