Úvod
Stĺpcová chromatografia je rozšírením tenkovrstvovej chromatografie (TLC). Predpokladá sa, že čitateľ má určité skúsenosti z laboratórnej praxe a zaoberal sa tenkovrstvovou chromatografiou. Namiesto nanášania vzorky na tenkú vrstvu oxidu kremičitého alebo oxidu hlinitého sa vzorka nanesie na valec s adsorbentom a rozpúšťadlo sa nepretržite aplikuje tlakom, kým sa zložky z valca úplne nevypustia. Vďaka tejto modifikácii možno zložky nielen oddeliť, ale aj zhromažďovať do rôznych nádob, čo umožňuje čistenie zmesí a oddelenie liečiv so znečistením. Kolónová chromatografia (známa aj ako "blesková chromatografia"), sa často používa vo výskumnom prostredí, o čom svedčí jej častý výskyt v procedurálnych častiach článkov v časopisoch.
Diskusia o postupoch
Na stĺpcovú chromatografiu sa vzťahujú rovnaké základné princípy tenkovrstvovej chromatografie (TLC). V skutočnosti sa TLC vždy vykonáva pred vykonaním kolóny, aby sa posúdila situácia a určil správny pomer rozpúšťadla. Na dosiahnutie dobrej separácie je ideálne, ak má požadovaná zložka Rf okolo 0,35 (prečítajte si o Rf v téme TLC) a je oddelená od ostatných zložiek aspoň 0,2 jednotky Rf. Ak sú škvrny, ktoré sa majú oddeliť, veľmi blízko (ak je rozdiel v Rf < 0,2), najlepšie je, ak má stred škvŕn Rf 0,35. Rf blízko 0,35 je ideálna, pretože je dostatočne pomalá, aby mohlo dôjsť k vyrovnaniu stacionárnej a mobilnej fázy, ale dostatočne rýchla, aby sa minimalizovalo rozšírenie pásov v dôsledku difúzie.
Existuje niekoľko premenných, ktoré sa nevzťahujú na TLC, ale ktoré ovplyvňujú separáciu zložiek v stĺpcovej chromatografii. Patrí k nim priemer kolóny, množstvo použitého adsorbentu a prietoková rýchlosť rozpúšťadla. Obr. 1 zobrazuje variabilné odporúčania na základe veľkosti vzorky a stupňa separácie zložiek. Vo všetkých scenároch sa majú kolóny pripravovať vo výške 12,5 až 15 cm.
Existuje niekoľko premenných, ktoré sa nevzťahujú na TLC, ale ktoré ovplyvňujú separáciu zložiek v stĺpcovej chromatografii. Patrí k nim priemer kolóny, množstvo použitého adsorbentu a prietoková rýchlosť rozpúšťadla. Obr. 1 zobrazuje variabilné odporúčania na základe veľkosti vzorky a stupňa separácie zložiek. Vo všetkých scenároch sa majú kolóny pripravovať vo výške 12,5 až 15 cm.
Napríklad kolóna s priemerom 2,5 cm by mala byť schopná prečistiť približne 400 mg materiálu, ak je separácia dobrá (ΔRf > 0,2, tretí stĺpec na obr. 1), alebo približne 160 mg, ak je separácia náročná (ΔRf > 0,1). Kolóna by sa mala dať pripraviť a eluovať s použitím približne 200 ml rozpúšťadla a frakcie sa môžu zbierať s približne 10 ml roztoku každá.
Existuje viacero variantov, ako fyzicky spustiť kolónu. Jedným z veľkých rozdielov v metódach je spôsob prípravy kolóny. Pri metóde "suchého balenia" sa suchý oxid kremičitý alebo oxid hlinitý pridáva priamo do kolóny a rozpúšťadlo sa nechá po častiach, potom pod tlakom, presakovať. Pri metóde "mokrého balenia" sa kolóna najprv naplní rozpúšťadlom, potom sa do nej zľahka vtlačí suchý oxid kremičitý alebo oxid hlinitý a potom sa plní tlakom. Pri metóde "suspenzie" sa rozpúšťadlo pridá do oxidu kremičitého alebo oxidu hlinitého v Erlenmeyerovej banke, naleje sa na kolónu ako kal, potom sa naplní tlakom (tlak sa môže vytvoriť injekčnou striekačkou).
Je dôležité vedieť, že pri pridávaní rozpúšťadla do oxidu kremičitého alebo oxidu hlinitého sa uvoľňuje teplo (majú exotermické rozpúšťacie teplo). V tejto časti je uvedená suspenzná metóda, ktorej hlavným dôvodom je, že umožňuje, aby sa tento exotermický krok uskutočnil v Erlenmeyerovej banke namiesto na kolóne. Ak sa počas plnenia kolóny uvoľní teplo, môže dôjsť k vytvoreniu bublín z varu rozpúšťadla. Tie môžu narušiť separáciu kolóny, ak sa dostatočne neodstránia, a môžu spôsobiť prasknutie adsorpčného materiálu v kolóne.
Existuje viacero variantov, ako fyzicky spustiť kolónu. Jedným z veľkých rozdielov v metódach je spôsob prípravy kolóny. Pri metóde "suchého balenia" sa suchý oxid kremičitý alebo oxid hlinitý pridáva priamo do kolóny a rozpúšťadlo sa nechá po častiach, potom pod tlakom, presakovať. Pri metóde "mokrého balenia" sa kolóna najprv naplní rozpúšťadlom, potom sa do nej zľahka vtlačí suchý oxid kremičitý alebo oxid hlinitý a potom sa plní tlakom. Pri metóde "suspenzie" sa rozpúšťadlo pridá do oxidu kremičitého alebo oxidu hlinitého v Erlenmeyerovej banke, naleje sa na kolónu ako kal, potom sa naplní tlakom (tlak sa môže vytvoriť injekčnou striekačkou).
Je dôležité vedieť, že pri pridávaní rozpúšťadla do oxidu kremičitého alebo oxidu hlinitého sa uvoľňuje teplo (majú exotermické rozpúšťacie teplo). V tejto časti je uvedená suspenzná metóda, ktorej hlavným dôvodom je, že umožňuje, aby sa tento exotermický krok uskutočnil v Erlenmeyerovej banke namiesto na kolóne. Ak sa počas plnenia kolóny uvoľní teplo, môže dôjsť k vytvoreniu bublín z varu rozpúšťadla. Tie môžu narušiť separáciu kolóny, ak sa dostatočne neodstránia, a môžu spôsobiť prasknutie adsorpčného materiálu v kolóne.
Postupy krok za krokom
a ) TLC zmesi ferocén/acetylferocén, b ) stĺpcová chromatografia
Kolóna zobrazená v tejto časti znázorňuje čistenie 0,20 g vzorky obsahujúcej zmes ferocénu a acetylferocénu (surová TLC je na obr. 2 a). Zhruba 8 ml frakcie sa zhromaždilo do malých skúmaviek a použilo sa približne 400 ml eluentu.
a) TLC platňa surovej zmesi ferocén/acetylferocén pred elúciou, b ) po elúcii, c ) kolóna s frítou, d ) kolóna s bavlneným klinom na dne, e) kolóna bez bavlneného klinu (pred použitím by sa musel vložiť)
Vykonajte TLC
1) Vykonajte TLC na vzorke, ktorá sa má čistiť (obr. 3 a a b), aby ste určili vhodné rozpúšťadlo na chromatografiu. Požadovaná zložka by mala mať Rf okolo 0,35 a v ideálnom prípade by mala byť oddelená od všetkých ostatných škvŕn aspoň 0,2 Rf jednotky.
2 ) Pripravte dávku eluentu, ktorý poskytuje správnu hodnotu Rf. Pripravené množstvo závisí od množstva vzorky, veľkosti kolóny a od toho, či sa v polovici prípravy plánuje zmena zloženia rozpúšťadla. (Pokyny nájdete na obr. 1 a v eluotropickom rade nájdete trendy v "sile rozpúšťadla").
2 ) Pripravte dávku eluentu, ktorý poskytuje správnu hodnotu Rf. Pripravené množstvo závisí od množstva vzorky, veľkosti kolóny a od toho, či sa v polovici prípravy plánuje zmena zloženia rozpúšťadla. (Pokyny nájdete na obr. 1 a v eluotropickom rade nájdete trendy v "sile rozpúšťadla").
Príprava balenej kolóny
3 ) Získajte vhodnú kolónu (pozri obr. 1) a uistite sa, že v blízkosti kohútika je niečo, čo umožní priechod kvapaliny, ale nie pevnej látky. Kolóny môžu mať spekaný disk (známy aj ako "frita"), obr. 3 c), alebo zátku z vaty alebo sklenej vaty, ktorá zostala po predchádzajúcom používateľovi (obr. 3 d). Ak nie je prítomný žiadny disk ani zátka (obr. 3 e), zaklinujte do dna kolóny malú vatu alebo sklenenú vatu pomocou dlhej tyče.
a) Nasypanie oxidu kremičitého do výšky 12,5 - 15 cm v digestore, b ) Nasypanie oxidu kremičitého do Erlenmeyerovej banky, c a d) Vytvorenie suspenzie
Bezpečnostné upozornenie: Práškový oxid kremičitý a oxid hlinitý dráždia pľúca a v digestore by sa s nimi malo vždy manipulovať opatrne. Rozsypaný prach by sa mal zlikvidovať utretím vlhkou papierovou utierkou (ak je mokrá, jemné častice sú menej disperzné).
5 ) V digestore nasypte adsorbent nameraný v kolóne do Erlenmeyerovej banky (obr. 4 b), potom pridajte trochu eluentu (obr. 4 c). Vytvorte sypkú kašu vírením a miešaním sklenenou miešacou tyčinkou (obr. 4 d), kým sa všetok adsorbent úplne nenamočí, neuvoľnia sa bublinky plynu a konzistencia nie je trochu hustá, ale sypká.
a ) nalievanie suspenzie do kolóny, b ) oplachovanie banky, c ) adsorbent prilepený na stenách kolóny, d) oplachovanie prilepeného adsorbentu
6 ) Pod zovretú kolónu umiestnite kadičku alebo Erlenmeyerovu banku a otvorte kohút. Jedným rýchlym pohybom roztočte a pomocou lievika s veľkým hrdlom nalejte kremičitú alebo hlinitú suspenziu do kolóny (obr. 5 a). Okamžite použite viac eluentu na vypláchnutie zvyšnej suspenzie z Erlenmeyerovej banky (obr. 5 b) a na kolónu.
7) Okamžite opláchnite všetok oxid kremičitý alebo hlinitý zo strán zásobníka kolóny pomocou eluentu a vírivým pohybom Pasteurovej pipety (obr. 5 c a d). Ak necháte adsorbent zaschnúť, priľne na sklo a nebude ho možné ľahko opláchnuť.
7) Okamžite opláchnite všetok oxid kremičitý alebo hlinitý zo strán zásobníka kolóny pomocou eluentu a vírivým pohybom Pasteurovej pipety (obr. 5 c a d). Ak necháte adsorbent zaschnúť, priľne na sklo a nebude ho možné ľahko opláchnuť.
a) Posúvanie stĺpca, aby sa odstránili vzduchové bubliny, b ) použitie tlaku vzduchu, c ) pridanie piesku, d) opláchnutie piesku zo strán
8) Pevne potraste stĺpcom pomocou korkového krúžku alebo kĺbov (obr. 6 a), aby ste odstránili všetky vzduchové bubliny v stĺpci (ktoré by mohli spôsobiť zlú separáciu alebo praskanie adsorbentu v stĺpci) a podporili rovnomerné ukladanie adsorbentu.
9) Jemným tlakom vzduchu na vrch kolóny (obr. 6 b) ju stlačte a zastavte, keď je hladina eluentu 1 cm od vrcholu kolóny. Ak sa použije T-adaptér so vzduchovým potrubím ako na obr. 6 b, jemnú reguláciu prietoku vzduchu možno dosiahnuť nastavením štipcovej svorky na gumovej hadičke. Počas celého elučného procesu udržiavajte biely stĺpec adsorbentu vlhký, pričom hladina eluentu musí byť nad hornou časťou oxidu kremičitého alebo oxidu hlinitého. Jemným porušením tesnenia ukončite pôsobenie tlaku a uzavrite uzatvárací kohút, aby ste zabránili ďalšiemu vytekaniu kvapaliny.
10 ) Pridajte tenkú vrstvu piesku (obr. 6 c), vysokú približne 0,5 cm. Strany kolóny opláchnite eluentom pomocou vírivého pohybu, aby sa piesok uvoľnil zo strán skla (obr. 6 d). Otvorte uzatvárací kohút a nechajte kvapalinu vytiecť, kým sa kvapalina nedostane tesne nad vrstvu piesku. Ak je kvapkanie príliš pomalé, použite tlak vzduchu.
9) Jemným tlakom vzduchu na vrch kolóny (obr. 6 b) ju stlačte a zastavte, keď je hladina eluentu 1 cm od vrcholu kolóny. Ak sa použije T-adaptér so vzduchovým potrubím ako na obr. 6 b, jemnú reguláciu prietoku vzduchu možno dosiahnuť nastavením štipcovej svorky na gumovej hadičke. Počas celého elučného procesu udržiavajte biely stĺpec adsorbentu vlhký, pričom hladina eluentu musí byť nad hornou časťou oxidu kremičitého alebo oxidu hlinitého. Jemným porušením tesnenia ukončite pôsobenie tlaku a uzavrite uzatvárací kohút, aby ste zabránili ďalšiemu vytekaniu kvapaliny.
10 ) Pridajte tenkú vrstvu piesku (obr. 6 c), vysokú približne 0,5 cm. Strany kolóny opláchnite eluentom pomocou vírivého pohybu, aby sa piesok uvoľnil zo strán skla (obr. 6 d). Otvorte uzatvárací kohút a nechajte kvapalinu vytiecť, kým sa kvapalina nedostane tesne nad vrstvu piesku. Ak je kvapkanie príliš pomalé, použite tlak vzduchu.
Pridajte vzorku
Po nanesení vzorky do kolóny nastane závod s časom, pretože difúzia začne materiál rozširovať. Vzorka by sa nemala aplikovať, kým nie ste pripravení okamžite a v celom rozsahu dokončiť kolónu. Tento proces môže trvať od 15 do 90 minút! Ak používate skúmavky na zber frakcií, skúmavky by sa mali pred pridaním vzorky usporiadať do stojana a výška kolóny by sa mala nastaviť tak, aby sa stojan so skúmavkami mohol posúvať pod ňu.
a) Rozpustenie pevnej látky malým množstvom dichlórmetánu, b ) Nanesenie vzorky, c ) Opláchnutie vzorky v banke, d) Tlakom sa vzorka natlačí na kolónu tesne za vrstvu piesku
11) Ak je surová vzorka kvapalina, použite ju priamo (prejdite na krok 13).
12 ) Ak je surová vzorka tuhá látka, vykonajte jednu z nasledujúcich činností.
12 ) Ak je surová vzorka tuhá látka, vykonajte jednu z nasledujúcich činností.
a ) Ideálna situácia: rozpustite pevnú látku v minimálnom množstve eluentu (najviac niekoľko ml).
b ) Ak pevná látka nie je zvlášť rozpustná alebo sa nerozpustí v niekoľkých ml eluentu, rozpustite ju v minimálnom množstve dichlórmetánu (najviac niekoľko ml, obr. 7 a).
c) Ak je tuhá látka v eluente nerozpustná, je možný aj alternatívny postup. Pevnú látku rozpustite v banke s okrúhlym dnom pomocou niekoľkých ml nízkovrúceho rozpúšťadla (napr. dichlórmetánu alebo acetónu). Do banky pridajte približne 1 g oxidu kremičitého alebo oxidu hlinitého, potom odstráňte rozpúšťadlo na rotačnej odparke, aby zostala tuhá látka, ktorá obsahuje vzorku usadenú na adsorbente. Keď je na vrchole zabalenej kolóny palec eluentu (ak sa použije táto metóda, vynechajte pridanie vrstvy piesku), nalejte vzorku adsorbovanú oxidom kremičitým na kolónu pomocou lievika so širokým hrdlom. Ak sa na sklo prilepí prach, opláchnite ho ďalším eluentom (prejdite na krok 15).
13) Jemne pridajte vzorku do kolóny pomocou pipety, kvapkajte kvapalinu alebo roztok priamo na piesok špičkou pipety čo najbližšie, nie po stranách (obr. 7 b). Dbajte na to, aby ste kvapalinu nevstrekovali násilne tak, že by sa v piesku alebo stĺpci oxidu kremičitého/hlinitého vytvorili zárezy.
14) Nádobu so vzorkou vypláchnite trochou rozpúšťadla (alebo dichlórmetánu, ak sa používa, obr. 7 c) a výplach pridajte do kolóny pomocou tej istej pipety (aby ste vypláchli aj pipetu).
15) Otvorte uzatvárací kohút a nechajte kvapkať kvapalinu, kým sa vzorka nedostane tesne za vrstvu piesku (obr. 7 d) a do bielej oblasti kolóny (ak to trvá dlhšie ako 20 sekúnd, použite tlak vzduchu).
16) Jemne opláchnite boky kolóny vírivým pohybom pomocou 1 - 2 pipiet plných eluentu, aby ste opláchli akúkoľvek postriekanú vzorku. Opäť nechajte kvapkať kvapalinu (alebo použite tlak vzduchu), kým sa vzorka nevtlačí do bieleho adsorbentu.
Opakujte krok oplachovania, kým si nebudete istí, že celá vzorka je uložená na adsorbente. Ak sa časť vzorky stále nachádza vo vrstve piesku, môže sa po pridaní ďalšieho rozpúšťadla rozpustiť v eluente, čo vedie k strate výťažku. Ak je zlúčenina farebná, oplach by mal byť úplne číry.
14) Nádobu so vzorkou vypláchnite trochou rozpúšťadla (alebo dichlórmetánu, ak sa používa, obr. 7 c) a výplach pridajte do kolóny pomocou tej istej pipety (aby ste vypláchli aj pipetu).
15) Otvorte uzatvárací kohút a nechajte kvapkať kvapalinu, kým sa vzorka nedostane tesne za vrstvu piesku (obr. 7 d) a do bielej oblasti kolóny (ak to trvá dlhšie ako 20 sekúnd, použite tlak vzduchu).
16) Jemne opláchnite boky kolóny vírivým pohybom pomocou 1 - 2 pipiet plných eluentu, aby ste opláchli akúkoľvek postriekanú vzorku. Opäť nechajte kvapkať kvapalinu (alebo použite tlak vzduchu), kým sa vzorka nevtlačí do bieleho adsorbentu.
Opakujte krok oplachovania, kým si nebudete istí, že celá vzorka je uložená na adsorbente. Ak sa časť vzorky stále nachádza vo vrstve piesku, môže sa po pridaní ďalšieho rozpúšťadla rozpustiť v eluente, čo vedie k strate výťažku. Ak je zlúčenina farebná, oplach by mal byť úplne číry.
a a b) Plnenie zásobníka rozpúšťadlom, c a d) Vyplavovanie kolóny
Naplnenieroztokom a elúcia kolóny
17) Jemne pridajte ďalšie množstvo eluentu pomocou pipety (obr. 8 a), vírením po stranách, a potom, keď by sa vrstva piesku už prídavkami nenarušila, opatrne nalejte väčšie množstvo (obr. 8 b) pripraveného eluentu, aby ste naplnili zásobník (alebo ho naplňte toľko, koľko môže byť potrebné). Čistý eluent zozbieraný počas plnenia kolóny sa môže opätovne použiť.
18) Pomocou tlaku vzduchu jemne a rovnomerne eluujte vzorku cez kolónu (obr. 8 c a d). Čím viackrát sa tlak spustí a zastaví, tým je pravdepodobnejšie, že kolóna môže prasknúť. Najlepšie je, ak sa dá tlak udržiavať celý čas jemne a rovnomerne.
Optimálna rýchlosť kvapkania počas elúcie závisí od veľkosti kolóny. Ideálny prietok eluentu je vtedy, keď rozpúšťadlo vo valcovej časti kolóny nad adsorbentom klesá rýchlosťou 5 cm za minútu. Preto by mala byť rýchlosť odkvapkávania pri úzkej kolóne pomalšia v porovnaní so širšou kolónou. Rýchlosť odkvapkávania pre jednopalcovú kolónu by mala byť taká, pri ktorej sa jednotlivé kvapky dajú sotva rozlíšiť. Prúd kvapaliny vytekajúci z kohútika pri tejto veľkosti kolóny je mierne príliš rýchly.
18) Pomocou tlaku vzduchu jemne a rovnomerne eluujte vzorku cez kolónu (obr. 8 c a d). Čím viackrát sa tlak spustí a zastaví, tým je pravdepodobnejšie, že kolóna môže prasknúť. Najlepšie je, ak sa dá tlak udržiavať celý čas jemne a rovnomerne.
Optimálna rýchlosť kvapkania počas elúcie závisí od veľkosti kolóny. Ideálny prietok eluentu je vtedy, keď rozpúšťadlo vo valcovej časti kolóny nad adsorbentom klesá rýchlosťou 5 cm za minútu. Preto by mala byť rýchlosť odkvapkávania pri úzkej kolóne pomalšia v porovnaní so širšou kolónou. Rýchlosť odkvapkávania pre jednopalcovú kolónu by mala byť taká, pri ktorej sa jednotlivé kvapky dajú sotva rozlíšiť. Prúd kvapaliny vytekajúci z kohútika pri tejto veľkosti kolóny je mierne príliš rýchly.
Obr
a-c) Zbieranie frakcií, d ) Spúšťanie kolóny
a-c) Zbieranie frakcií, d ) Spúšťanie kolóny
Zber frakcií
19 ) Okamžite začnite zbierať elučnú kvapalinu do skúmaviek na stojane (obr. 9 a). Odporúčania týkajúce sa objemov, ktoré sa majú zbierať do jednotlivých skúmaviek, nájdete na obr. 1.20) Keď sa naplní prvá skúmavka alebo ak sa nazbierala určitá výška kvapaliny podľa odporúčaní inštruktora alebo Obr.1, presuňte stojan a začnite zbierať do inej skúmavky (Obr.9 b a c). Naplňte a udržiavajte skúmavky na stojane v poradí.
Tieto rôzne skúmavky sa nazývajú "frakcie". Cieľom kolóny je zbierať dostatočne malé frakcie, aby väčšina (alebo niektoré) frakcie obsahovali čistý materiál. Ak je separácia zmesi náročná (ak je ΔRf zložiek nízky), môže byť najlepšie zbierať malé frakcie (napr. z polovice naplnené skúmavky).
Tieto rôzne skúmavky sa nazývajú "frakcie". Cieľom kolóny je zbierať dostatočne malé frakcie, aby väčšina (alebo niektoré) frakcie obsahovali čistý materiál. Ak je separácia zmesi náročná (ak je ΔRf zložiek nízky), môže byť najlepšie zbierať malé frakcie (napr. z polovice naplnené skúmavky).
a-c) Oplachovací materiál rozstrekovaný na špičke kolóny, d) Študenti, ktorí spúšťajú kolónu.
21) Keď kvapalina odteká z kolóny, často sa rozstrekuje na vonkajšie strany hrotu kolóny a keď sa rozpúšťadlo odparí, môžete na hrote vidieť prstenec materiálu (uvidíte prstenec pevnej látky, ak je zložka pevná ako na obr. 10 b, alebo olejové kvapky, ak je zložka kvapalná). Ak sú zložky farebné, hrot kolóny by sa mal opláchnuť (obr. 10 c), keď sa zdá, že jedna zložka sa úplne eluovala, a predtým, ako sa priblíži druhá zložka.
22 ) Pravidelne sledujte hladinu eluentu a doplňte ju skôr, ako klesne pod vrstvu piesku.
22 ) Pravidelne sledujte hladinu eluentu a doplňte ju skôr, ako klesne pod vrstvu piesku.
a ) Elucia, b ) Pridanie etylacetátu na zvýšenie polarity rozpúšťadla, c ) Hladina rozpúšťadla sa blíži k vrstve piesku, d) Doplnenie
Prípadné zvýšenie polarity rozpúšťadla
23) V celej kolóne sa môže použiť jeden eluent, najmä ak zložky, ktoré sa majú oddeliť, majú podobné hodnoty Rf. Ak však majú zložky veľmi rozdielne hodnoty Rf, polarita rozpúšťadla sa môže zvýšiť po elúcii jednej zložky z kolóny (obr. 11 a).
Zvýšenie polarity rozpúšťadla spôsobí, že zložky sa budú pohybovať "rýchlejšie." Existuje niekoľko dôvodov, prečo je rýchlejšia elúcia žiaduca. Po prvé, ak už jedna zložka opustila kolónu, kolóna už vykonala svoju prácu pri separácii, takže urýchlenie procesu neovplyvní čistotu zozbieraných frakcií. Po druhé, čím dlhšie bude kolóna pracovať, tým širšie budú pásy zložiek (v dôsledku difúzie) a pri zbere širokého pásma materiálu sa spotrebuje (a minie) veľa rozpúšťadla.
Zvýšenie polarity rozpúšťadla spôsobí, že zložky sa budú pohybovať "rýchlejšie." Existuje niekoľko dôvodov, prečo je rýchlejšia elúcia žiaduca. Po prvé, ak už jedna zložka opustila kolónu, kolóna už vykonala svoju prácu pri separácii, takže urýchlenie procesu neovplyvní čistotu zozbieraných frakcií. Po druhé, čím dlhšie bude kolóna pracovať, tým širšie budú pásy zložiek (v dôsledku difúzie) a pri zbere širokého pásma materiálu sa spotrebuje (a minie) veľa rozpúšťadla.
Obsahuje čiastočný zoznam eluotropických radov, zoznam bežných rozpúšťadiel zoradených podľa ich "rozpúšťacej sily" v normálnej fázovej chromatografii. Polárnejšie rozpúšťadlo spôsobuje najvýraznejší nárast Rf
24) Na zvýšenie polarity rozpúšťadla možno polárne rozpúšťadlo nakvapkať priamo do eluentu na zásobníku kolóny (obr. 11 b). Napríklad, ak sa používa zmes hexánov a etylacetátu, pridaním čistého etylacetátu do eluentu, ktorý je práve v zásobníku, sa zvýši jeho polarita. Ak je hladina eluentu nízka, mohol by sa pripraviť roztok, ktorý obsahuje vyšší podiel polárnejšej zložky. Napríklad, ak sa v kolóne najprv použila zmes hexánov a etylacetátu v pomere 4:1, použitím zmesi v pomere 1:1 by sa dosiahlo polárnejšie rozpúšťadlo.
25) Kolónu eluujte polárnejším rozpúšťadlom ako predtým a vždy nezabudnite sledovať hladinu eluentu a doplňte ju (obr. 11 d) skôr, ako klesne pod vrstvu piesku.
26) Ak chcete zvýšiť polaritu rozpúšťadla, polárne rozpúšťadlo môžete nakvapkať priamo do eluentu na zásobníku kolóny (obr. 11 b). Napríklad, ak sa používa zmes hexánov a etylacetátu, pridaním čistého etylacetátu do eluentu, ktorý je práve v zásobníku, sa zvýši jeho polarita. Ak je hladina eluentu nízka, mohol by sa pripraviť roztok, ktorý obsahuje vyšší podiel polárnejšej zložky. Napríklad, ak sa v kolóne najprv použila zmes hexánov a etylacetátu v pomere 4:1, použitím zmesi v pomere 1:1 by sa dosiahlo polárnejšie rozpúšťadlo.
27) Kolónu eluujte polárnejším rozpúšťadlom ako predtým a vždy nezabudnite sledovať hladinu eluentu a doplňte ju (obr. 11 d) skôr, ako klesne pod vrstvu piesku.
25) Kolónu eluujte polárnejším rozpúšťadlom ako predtým a vždy nezabudnite sledovať hladinu eluentu a doplňte ju (obr. 11 d) skôr, ako klesne pod vrstvu piesku.
26) Ak chcete zvýšiť polaritu rozpúšťadla, polárne rozpúšťadlo môžete nakvapkať priamo do eluentu na zásobníku kolóny (obr. 11 b). Napríklad, ak sa používa zmes hexánov a etylacetátu, pridaním čistého etylacetátu do eluentu, ktorý je práve v zásobníku, sa zvýši jeho polarita. Ak je hladina eluentu nízka, mohol by sa pripraviť roztok, ktorý obsahuje vyšší podiel polárnejšej zložky. Napríklad, ak sa v kolóne najprv použila zmes hexánov a etylacetátu v pomere 4:1, použitím zmesi v pomere 1:1 by sa dosiahlo polárnejšie rozpúšťadlo.
27) Kolónu eluujte polárnejším rozpúšťadlom ako predtým a vždy nezabudnite sledovať hladinu eluentu a doplňte ju (obr. 11 d) skôr, ako klesne pod vrstvu piesku.
a ) Pôvodná TLC platňa, b ) Frakcie zozbierané kolónou, c) Frakcie na TLC platni, d) Vizualizovaná TLC platňa so vzorkami jednotlivých frakcií.
Vyhľadanie a zahustenie požadovanej zložky
28) Pri hľadaní požadovanej zložky vo frakciách v skúmavke je užitočné pochopiť vzťah medzi Rf a poradím elúcie v chromatografii na kolóne.V stĺpcovej chromatografii sa vzorka ukladá na čele kolóny a eluuje sa smerom nadol, zatiaľ čo v tenkovrstvovej chromatografii sa vzorka nanesie na dno platne a eluuje sa smerom nahor. Preto si možno kolónu predstaviť ako obrátenú TLC platňu. Zlúčenina s vyšším Rf vytečie "rýchlejšie", čo znamená, že skončí vyššie na TLC platni a kolóna ju zachytí ako prvú. V kolóne zobrazenej v tejto časti je zložka s nižším Rf (oranžová na TLC platni na obr. 13 a) zložkou, ktorá sa z kolóny zbiera ako druhá.
29) Najprv určte, ktoré skúmavky obsahujú rozpustenú zlúčeninu.
29) Najprv určte, ktoré skúmavky obsahujú rozpustenú zlúčeninu.
a) Na TLC platničku označenú číslami frakcií zodpovedajúcimi poradiu, v akom boli zozbierané, umiestnite vzorku každej frakcie (obr. 13 c). Najlepšie môže byť každú vzorku škvrniť 2 - 3-krát nad sebou v prípade, že sú frakcie zriedené.
b) Ak sa nazbieralo veľa frakcií, kvôli čomu váhate s odobratím vzorky z každej frakcie, jednou z metód identifikácie bezfarebných frakcií, ktoré môžu obsahovať zlúčeninu, je hľadanie náznaku zvyškov vedúcich k skúmavkám. Po odparení niekedy zostáva na vrchole skúmavky pevný zvyšok (obr. 13) alebo olejové kvapôčky, z ktorých je zrejmé, že tieto frakcie obsahujú viac ako len rozpúšťadlo. Odoberte vzorky všetkých frakcií v blízkosti skúmaviek, ktoré obsahujú viditeľný zvyšok.
c ) Vizualizujte škvrnitú TLC platňu pomocou UV svetla a/alebo farbiva, aby ste určili, ktoré frakcie obsahujú zlúčeninu (obr. 13 d)
a ) Eluované TLC platne frakcií obsahujúcich možnú zlúčeninu, b ) Kombinácia frakcií, c) Preplachovanie skúmavky s frakciou
28) Vykonajte TLC všetkých frakcií, ktoré obsahujú zlúčeninu, pričom na 2,5 cm širokú TLC platňu naneste až päť vzoriek. Na tento účel sa môžu použiť širšie TLC platne, ak sú k dispozícii.
29) Identifikujte zlúčeninu s požadovaným Rf porovnaním s pôvodnou surovou TLC platňou. Rozhodnite sa ponechať si frakcie, ktoré majú požadovanú zlúčeninu v čistej forme, ako to dokazuje eluovaná TLC platňa. Napríklad ak je na obr. 15 a požadovaná zlúčenina s vyšším Rf, mali by sa ponechať frakcie 6 - 10.
30 ) Spojte čisté frakcie do primerane veľkej banky s okrúhlym dnom (nie viac ako do polovice naplnenej, obr. 15 b). Každú skúmavku vypláchnite malým množstvom eluentu (alebo iného rozpúšťadla, ak je problémom rozpustnosť) a výplach pridajte do banky s okrúhlym dnom (obr. 15 c).
31) Odparte rozpúšťadlo na rotačnej odparke, aby v banke zostala prečistená zlúčenina.
29) Identifikujte zlúčeninu s požadovaným Rf porovnaním s pôvodnou surovou TLC platňou. Rozhodnite sa ponechať si frakcie, ktoré majú požadovanú zlúčeninu v čistej forme, ako to dokazuje eluovaná TLC platňa. Napríklad ak je na obr. 15 a požadovaná zlúčenina s vyšším Rf, mali by sa ponechať frakcie 6 - 10.
30 ) Spojte čisté frakcie do primerane veľkej banky s okrúhlym dnom (nie viac ako do polovice naplnenej, obr. 15 b). Každú skúmavku vypláchnite malým množstvom eluentu (alebo iného rozpúšťadla, ak je problémom rozpustnosť) a výplach pridajte do banky s okrúhlym dnom (obr. 15 c).
31) Odparte rozpúšťadlo na rotačnej odparke, aby v banke zostala prečistená zlúčenina.
a ) Použitie tlaku vzduchu na vysušenie kolóny, b ) Nechanie kolóny vyschnúť hore dnom, c) Zbieranie odpadového oxidu kremičitého
Vyčisteniekolóny
32) Na vysušenie kolóny použite tlak vzduchu na vypustenie väčšiny eluentu z kolóny do odpadovej nádoby. Potom kolónu ďalej vysušte pomocou jednej z týchto metód.
a) Nechajte pripojený jemný prúd vzduchu prúdiť cez kolónu, aby ste ju ďalej vysušili, kým budete čistiť ostatné veci (obr. 16 a).
b) Kolónu upnite hore dnom nad veľkú odpadovú kadičku v digestore, aby adsorbent po vysušení spadol (obr. 16 b). Bude to trvať dlho (do ďalšej vyučovacej hodiny), ale je to jedna z možností.
33) Po vyschnutí možno adsorbent vysypať z kolóny do odpadovej nádoby v digestore (obr. 16 c).
Bezpečnostné upozornenie: Práškové adsorbenty dráždia pľúca a ich nebezpečnosť sa zvyšuje, ak kolóna obsahuje zvyšky zlúčenín, ktoré sa teraz môžu dostať do pľúc. Sypanie práškového oxidu kremičitého alebo oxidu hlinitého by sa malo vždy vykonávať v digestore.
34) Keď sa väčšina adsorbentu zhromaždí v odpadovej nádobe, použite vodu na vypláchnutie všetkých zvyškov pevných látok do umývadla a potom prepláchnite kolónu acetónom do odpadovej kadičky. Ďalej kolónu vyčistite mydlom a vodou a vysušte s oddelenými časťami kohútika.
Bezpečnostné upozornenie: Práškové adsorbenty dráždia pľúca a ich nebezpečnosť sa zvyšuje, ak kolóna obsahuje zvyšky zlúčenín, ktoré sa teraz môžu dostať do pľúc. Sypanie práškového oxidu kremičitého alebo oxidu hlinitého by sa malo vždy vykonávať v digestore.
34) Keď sa väčšina adsorbentu zhromaždí v odpadovej nádobe, použite vodu na vypláchnutie všetkých zvyškov pevných látok do umývadla a potom prepláchnite kolónu acetónom do odpadovej kadičky. Ďalej kolónu vyčistite mydlom a vodou a vysušte s oddelenými časťami kohútika.
Riešenie problémov
Vkolóne sa objavujú vzduchové bubliny
Vzduchová bublina je prázdna kapsa, v ktorej nedochádza k vyrovnávaniu stacionárnej a mobilnej fázy, takže zložky sa pohybujú okolo vzduchovej bubliny rýchlejšie, ako by mali. To môže viesť k nerovnomernému eluovaniu pásov, čo môže spôsobiť prekrývanie, ak je separácia zmesi náročná (ak majú zložky veľmi blízke hodnoty Rf, ako na obr. 17).
Ak sa v kolóne objavia vzduchové bubliny a piesok alebo vzorka ešte neboli aplikované, počas balenia kolónu poriadne potraste, aby sa odstránili všetky vzduchové bubliny. Ak sa bubliny nepohnú, obráťte sa na inštruktora, pretože ste k úlohe možno pristúpili príliš jemne. Ak už bol piesok alebo vzorka nanesená, najlepšie je nechať kolónu tak, ako je, a dúfať, že vzduchové bubliny neovplyvnia separáciu.
Pásma sa eluujú nerovnomerne
Ak sú zložky zmesi farebné, môže byť zrejmé, keď sa pásy eluujú krivo. Je to s najväčšou pravdepodobnosťou spôsobené tým, že kolóna je upnutá mierne šikmo. Ak je kolóna upnutá šikmo, zložky budú putovať šikmo (obr. 18). To môže spôsobiť problémy s oddeľovaním, ak majú komponenty podobné Rf.
Neexistuje spôsob, ako tento problém vyriešiť v polovici stĺpca, ale ak majú komponenty veľmi rozdielne hodnoty Rf, šikmé pásy nemusia mať na separáciu žiadny vplyv. V budúcnosti nezabudnite skontrolovať, či je stĺpec dokonale zvislý v smere zo strany na stranu aj spredu dozadu.
Last edited by a moderator:
