Introdução
A cromatografia em coluna é uma extensão da cromatografia em camada fina (CCF). Parte-se do princípio de que o leitor tem alguma experiência na prática laboratorial e já lidou com a cromatografia em camada fina. Em vez de aplicar uma amostra sobre uma camada fina de sílica ou alumina, a amostra é depositada num cilindro de adsorvente e o solvente é continuamente aplicado com pressão até que os componentes sejam completamente drenados do cilindro. Com esta modificação, os componentes podem ser não só separados como também recolhidos em diferentes recipientes, permitindo a purificação de misturas e a separação de medicamentos com poluentes. A cromatografia em coluna (também conhecida como "cromatografia flash") é frequentemente utilizada em contextos de investigação, como é evidenciado pela sua ocorrência comum nas secções de procedimentos de artigos de revistas.
Discussão processual
Os mesmos princípios subjacentes à cromatografia em camada fina (CCF) aplicam-se à cromatografia em coluna. De facto, antes de realizar uma coluna, é sempre efectuada uma CCF para avaliar a situação e determinar a proporção adequada de solvente. Para obter uma boa separação, o ideal é que o componente desejado tenha um Rf de cerca de 0,35 (leia sobre Rf no tópico TLC) e esteja separado dos outros componentes por pelo menos 0,2 unidades Rf. Se as manchas a serem separadas estiverem muito próximas (se a diferença em Rf for < 0,2), é melhor que o meio das manchas tenha um Rf de 0,35. Um Rf próximo de 0,35 é ideal porque é suficientemente lento para que possa ocorrer o equilíbrio entre a fase estacionária e a fase móvel, mas suficientemente rápido para minimizar o alargamento da banda devido à difusão.
Existem algumas variáveis que não são aplicáveis à TLC, mas que afectam a separação de componentes na cromatografia em coluna. Estas incluem o diâmetro da coluna, a quantidade de adsorvente utilizada e o caudal do solvente. A Fig. 1 mostra recomendações variáveis baseadas no tamanho da amostra e no grau de separação entre componentes. Em todos os cenários, as colunas devem ser preparadas entre 12,5-15 cm de altura.
Existem algumas variáveis que não são aplicáveis à TLC, mas que afectam a separação de componentes na cromatografia em coluna. Estas incluem o diâmetro da coluna, a quantidade de adsorvente utilizada e o caudal do solvente. A Fig. 1 mostra recomendações variáveis baseadas no tamanho da amostra e no grau de separação entre componentes. Em todos os cenários, as colunas devem ser preparadas entre 12,5-15 cm de altura.
Por exemplo, uma coluna de 2,5 cm deve ser capaz de purificar cerca de 400 mg de material se a separação for boa (ΔRf > 0,2, terceira coluna na Fig. 1), ou cerca de 160 mg se a separação for difícil (ΔRf > 0,1). A coluna deve poder ser preparada e eluída com cerca de 200 ml de solvente, e as fracções podem ser recolhidas com cerca de 10 ml de solução cada.
Existem múltiplas variações sobre a forma de efetuar fisicamente uma coluna. Uma grande diferença entre os métodos é a forma como a coluna é preparada. No método de "embalagem a seco", a sílica ou alumina seca é adicionada diretamente a uma coluna e o solvente é deixado a escorrer em porções e depois com pressão. No método de "enchimento húmido", a coluna é enchida primeiro com solvente, depois a sílica ou alumina seca é ligeiramente agitada e, em seguida, enchida com pressão. No método "slurry", o solvente é adicionado à sílica ou alumina num frasco Erlenmeyer, vertido na coluna como um material lamacento e depois embalado com pressão (a pressão pode ser produzida por uma seringa).
É importante saber que o calor é libertado quando o solvente é adicionado à sílica ou à alumina (têm um calor exotérmico de solvatação). O método do chorume é apresentado nesta secção, sendo a principal razão o facto de permitir que este passo exotérmico ocorra num Erlenmeyer em vez de na coluna. Se o calor for libertado durante o enchimento da coluna, pode gerar bolhas resultantes da ebulição do solvente. Estas podem interferir com a separação da coluna se não forem adequadamente removidas, e podem quebrar o material adsorvente na coluna.
Existem múltiplas variações sobre a forma de efetuar fisicamente uma coluna. Uma grande diferença entre os métodos é a forma como a coluna é preparada. No método de "embalagem a seco", a sílica ou alumina seca é adicionada diretamente a uma coluna e o solvente é deixado a escorrer em porções e depois com pressão. No método de "enchimento húmido", a coluna é enchida primeiro com solvente, depois a sílica ou alumina seca é ligeiramente agitada e, em seguida, enchida com pressão. No método "slurry", o solvente é adicionado à sílica ou alumina num frasco Erlenmeyer, vertido na coluna como um material lamacento e depois embalado com pressão (a pressão pode ser produzida por uma seringa).
É importante saber que o calor é libertado quando o solvente é adicionado à sílica ou à alumina (têm um calor exotérmico de solvatação). O método do chorume é apresentado nesta secção, sendo a principal razão o facto de permitir que este passo exotérmico ocorra num Erlenmeyer em vez de na coluna. Se o calor for libertado durante o enchimento da coluna, pode gerar bolhas resultantes da ebulição do solvente. Estas podem interferir com a separação da coluna se não forem adequadamente removidas, e podem quebrar o material adsorvente na coluna.
Procedimentos passo a passo
a) TLC da mistura ferroceno/acetilferroceno, b) Cromatografia em coluna
A coluna ilustrada nesta secção mostra a purificação de uma amostra de 0,20 g contendo uma mistura de ferroceno e acetilferroceno (TLC em bruto na Fig.2 a). Foram recolhidas fracções de cerca de 8 ml em pequenos tubos de ensaio e foram utilizados cerca de 400 ml de eluente.
a) Placa TLC da mistura bruta de ferroceno/acetilferroceno antes da eluição, b) Após a eluição, c) Coluna com frita, d) Coluna com algodão inserido no fundo, e) Coluna sem o algodão (teria de ser inserido antes da utilização)
Efetuarum TLC
1) Efetuar um TLC na amostra a purificar (Fig.3 a e b) para determinar o solvente adequado para a cromatografia. O componente desejado deve ter um Rf de cerca de 0,35 e, idealmente, deve estar separado de todos os outros pontos por, pelo menos, 0,2 unidades de Rf.
2) Preparar um lote de eluente que dê o valor Rf correto. A quantidade preparada depende da quantidade de amostra, do tamanho da coluna e do facto de se planear alterar a composição do solvente a meio do processo. (Ver Fig. 1 para orientações e a série eluotrópica para tendências na "potência do solvente").
2) Preparar um lote de eluente que dê o valor Rf correto. A quantidade preparada depende da quantidade de amostra, do tamanho da coluna e do facto de se planear alterar a composição do solvente a meio do processo. (Ver Fig. 1 para orientações e a série eluotrópica para tendências na "potência do solvente").
Preparar a coluna de enchimento
3) Obter uma coluna adequada (ver Fig. 1) e certificar-se de que existe algo perto da torneira que permita a passagem de líquido, mas não de sólido. As colunas podem ter um disco sinterizado (também conhecido por "frita"), Fig. 3 c), ou um tampão de algodão ou lã de vidro remanescente do utilizador anterior (Fig. 3 d). Se não houver nenhum disco ou tampão (Fig.3 e), introduz-se um pequeno chumaço de algodão ou lã de vidro no fundo da coluna com uma vara comprida.
a) Colocar a sílica a 12,5-15 cm de altura na hotte, b) Colocar a sílica num Erlenmeyer, c e d) Fazer uma pasta
Nota de segurança: A sílica em pó e a alumina são irritantes para os pulmões e devem ser manuseadas cuidadosamente numa hotte. O pó derramado deve ser eliminado com uma toalha de papel molhada (se estiver molhado, as partículas finas são menos dispersivas).
5) Na hotte, verter o adsorvente medido na coluna para um Erlenmeyer (Fig.4 b) e adicionar um pouco de eluente (Fig.4 c). Fazer uma pasta solta, rodando e mexendo com uma vareta de vidro (Fig.4 d) até que todo o adsorvente esteja completamente molhado, as bolhas de gás sejam libertadas e a consistência seja algo espessa, mas derramável.
a) Deitar a pasta na coluna, b) Lavar o frasco, c) Adsorvente aderido aos lados da coluna, d) Lavar o adsorvente aderente
6) Colocar um copo ou um Erlenmeyer por baixo da coluna fixada e abrir a torneira. Num movimento rápido, agitar e verter a lama de sílica ou de alumina na coluna utilizando um funil de boca larga (Fig. 5 a). Utilizar imediatamente mais eluente para enxaguar a lama residual do frasco Erlenmeyer (Fig. 5 b) e para a coluna.
7) Enxaguar imediatamente qualquer sílica ou alumina dos lados do reservatório da coluna utilizando eluente e um movimento giratório de uma pipeta Pasteur (Fig. 5 c e d). Se deixar secar, o adsorvente agarrar-se-á ao vidro e não poderá ser facilmente enxaguado.
7) Enxaguar imediatamente qualquer sílica ou alumina dos lados do reservatório da coluna utilizando eluente e um movimento giratório de uma pipeta Pasteur (Fig. 5 c e d). Se deixar secar, o adsorvente agarrar-se-á ao vidro e não poderá ser facilmente enxaguado.
a) Agitar a coluna para retirar as bolhas de ar, b) Aplicar pressão de ar, c) Adicionar areia, d) Enxaguar a areia dos lados
8) Agitar a coluna com firmeza, utilizando um anel de cortiça ou os nós dos dedos (Fig. 6 a), para desalojar eventuais bolhas de ar na coluna (que podem provocar uma separação deficiente ou a fissuração do adsorvente na coluna) e para promover uma deposição homogénea do adsorvente.
9) Aplicar uma ligeira pressão de ar no topo da coluna (Fig.6 b) para a comprimir, parando quando o nível do eluente estiver a 1 cm do topo da coluna. Se for utilizado um adaptador em T com a linha de ar, como na Fig. 6 b, o controlo fino do fluxo de ar pode ser efectuado através do ajuste da pinça de aperto na tubagem de borracha. Durante todo o processo de eluição, manter a coluna branca de adsorvente húmida, com o nível do eluente acima do topo da sílica ou alumina. Quebre suavemente o selo para cessar a aplicação de pressão e feche a torneira para evitar que o líquido continue a escorrer.
10) Adicionar uma camada fina de areia (Fig.6 c), com cerca de 0,5 cm de altura. Lavar os lados da coluna com eluente, utilizando um movimento de rotação para desalojar a areia dos lados do vidro (Fig. 6 d). Abrir a torneira e deixar escorrer o líquido até que este se encontre imediatamente acima da camada de areia. Aplicar pressão de ar se o gotejamento for demasiado lento.
9) Aplicar uma ligeira pressão de ar no topo da coluna (Fig.6 b) para a comprimir, parando quando o nível do eluente estiver a 1 cm do topo da coluna. Se for utilizado um adaptador em T com a linha de ar, como na Fig. 6 b, o controlo fino do fluxo de ar pode ser efectuado através do ajuste da pinça de aperto na tubagem de borracha. Durante todo o processo de eluição, manter a coluna branca de adsorvente húmida, com o nível do eluente acima do topo da sílica ou alumina. Quebre suavemente o selo para cessar a aplicação de pressão e feche a torneira para evitar que o líquido continue a escorrer.
10) Adicionar uma camada fina de areia (Fig.6 c), com cerca de 0,5 cm de altura. Lavar os lados da coluna com eluente, utilizando um movimento de rotação para desalojar a areia dos lados do vidro (Fig. 6 d). Abrir a torneira e deixar escorrer o líquido até que este se encontre imediatamente acima da camada de areia. Aplicar pressão de ar se o gotejamento for demasiado lento.
Adicionar a amostra
Quando a amostra é aplicada na coluna, há uma corrida contra o tempo, uma vez que a difusão começará a alargar o material. Não deve ser aplicada uma amostra até estar pronto para completar a coluna imediatamente e na sua totalidade. Este processo pode demorar entre 15 e 90 minutos! Se utilizar tubos de ensaio para recolher fracções, os tubos de ensaio devem ser dispostos num suporte antes de adicionar a amostra e a altura da coluna deve ser ajustada de modo a que o suporte para tubos de ensaio possa deslizar por baixo.
a) Dissolver um sólido com uma pequena quantidade de diclorometano, b) Aplicar a amostra, c) Enxaguar a amostra no seu frasco, d) Aplicar pressão para empurrar a amostra para a coluna logo após a camada de areia
11) Se a amostra bruta for líquida, utilizá-la diretamente (passar à etapa 13).
12) Se a amostra bruta for um sólido, efetuar uma das seguintes operações
12) Se a amostra bruta for um sólido, efetuar uma das seguintes operações
a) Situação ideal: dissolver o sólido na quantidade mínima de eluente (alguns ml no máximo).
b) Se o sólido não for particularmente solúvel ou não se dissolver em alguns ml de eluente, dissolvê-lo na quantidade mínima de diclorometano (alguns ml no máximo, Fig.7 a).
c) Se o sólido for insolúvel no eluente, é também possível um procedimento alternativo. Dissolver o sólido num balão de fundo redondo, utilizando alguns ml de um solvente de baixo ponto de ebulição (por exemplo, diclorometano ou acetona). Adicionar ao balão cerca de 1 g de sílica ou de alumina e, em seguida, remover o solvente no evaporador rotativo para deixar um sólido que contenha a amostra depositada no adsorvente. Com uma polegada de eluente a repousar no topo da coluna (saltar a adição da camada de areia se este método for utilizado), verter a amostra adsorvida em sílica para a coluna utilizando um funil de boca larga. Se alguma poeira se agarrar ao vidro, enxaguar com mais eluente (passar à etapa 15).
13) Adicionar delicadamente a amostra à coluna por meio de uma pipeta, gotejando o líquido ou a solução diretamente sobre a areia com a ponta da pipeta o mais próximo possível, sem descer pelos lados (Fig. 7 b). Ter o cuidado de não esguichar o líquido com força, de modo a provocar reentrâncias na areia ou na coluna de sílica/alumina.
14) Lavar o recipiente de recolha de amostras com um pouco de solvente (ou diclorometano, se for utilizado, Fig. 7 c) e adicionar o líquido de lavagem à coluna utilizando a mesma pipeta (para lavar também a pipeta).
15) Abrir a torneira e deixar escorrer o líquido até que a amostra ultrapasse a camada de areia (Fig. 7 d) e entre na zona branca da coluna (aplicar pressão de ar se este processo demorar mais de 20 segundos).
16) Enxaguar suavemente os lados da coluna com um movimento giratório, utilizando 1-2 pipetas cheias de eluente para enxaguar qualquer amostra salpicada. Mais uma vez, deixar escorrer o líquido (ou aplicar pressão de ar) até que a amostra seja empurrada para o adsorvente branco.
Repetir o passo de enxaguamento até ter a certeza de que toda a amostra está depositada no adsorvente. Se ainda houver alguma amostra na camada de areia, esta pode dissolver-se no eluente quando se adiciona mais solvente, levando a uma perda de rendimento. Se o composto for colorido, o enxaguamento deve ser completamente transparente.
14) Lavar o recipiente de recolha de amostras com um pouco de solvente (ou diclorometano, se for utilizado, Fig. 7 c) e adicionar o líquido de lavagem à coluna utilizando a mesma pipeta (para lavar também a pipeta).
15) Abrir a torneira e deixar escorrer o líquido até que a amostra ultrapasse a camada de areia (Fig. 7 d) e entre na zona branca da coluna (aplicar pressão de ar se este processo demorar mais de 20 segundos).
16) Enxaguar suavemente os lados da coluna com um movimento giratório, utilizando 1-2 pipetas cheias de eluente para enxaguar qualquer amostra salpicada. Mais uma vez, deixar escorrer o líquido (ou aplicar pressão de ar) até que a amostra seja empurrada para o adsorvente branco.
Repetir o passo de enxaguamento até ter a certeza de que toda a amostra está depositada no adsorvente. Se ainda houver alguma amostra na camada de areia, esta pode dissolver-se no eluente quando se adiciona mais solvente, levando a uma perda de rendimento. Se o composto for colorido, o enxaguamento deve ser completamente transparente.
a e b) Enchimento do reservatório de solvente, c e d) Eluição da coluna
Enchercom Eluente e Eluir a Coluna
17) Adicionar delicadamente mais eluente através de uma pipeta (Fig. 8 a), agitando os lados e, em seguida, quando a camada de areia já não for perturbada pelas adições, deitar cuidadosamente quantidades maiores (Fig. 8 b) do eluente preparado para encher o reservatório (ou encher com a quantidade que for necessária). O eluente limpo recolhido durante o enchimento da coluna pode ser reutilizado.
18) Utilizar a pressão de ar para eluir suave e continuamente a amostra através da coluna (Fig.8 c e d). Quanto mais vezes a pressão for iniciada e interrompida, maior é a probabilidade de a coluna rachar. É preferível que a pressão se mantenha suave e constante durante todo o tempo.
A taxa de gotejamento óptima durante a eluição depende do tamanho da coluna. O fluxo ideal de eluente é quando o solvente na secção cilíndrica da coluna acima do adsorvente cai a 5 cm por minuto. Por conseguinte, a velocidade de gotejamento deve ser mais lenta com uma coluna estreita do que com uma coluna mais larga. A velocidade de gotejamento para uma coluna de uma polegada deve ser tal que as gotas individuais mal se possam distinguir. Um fluxo de líquido a sair pela torneira com este tamanho de coluna é ligeiramente demasiado rápido.
18) Utilizar a pressão de ar para eluir suave e continuamente a amostra através da coluna (Fig.8 c e d). Quanto mais vezes a pressão for iniciada e interrompida, maior é a probabilidade de a coluna rachar. É preferível que a pressão se mantenha suave e constante durante todo o tempo.
A taxa de gotejamento óptima durante a eluição depende do tamanho da coluna. O fluxo ideal de eluente é quando o solvente na secção cilíndrica da coluna acima do adsorvente cai a 5 cm por minuto. Por conseguinte, a velocidade de gotejamento deve ser mais lenta com uma coluna estreita do que com uma coluna mais larga. A velocidade de gotejamento para uma coluna de uma polegada deve ser tal que as gotas individuais mal se possam distinguir. Um fluxo de líquido a sair pela torneira com este tamanho de coluna é ligeiramente demasiado rápido.
a-c) Recolha de fracções, d) Funcionamento de uma coluna
Recolher as fracções
19) Comece imediatamente a recolher o líquido de eluição em tubos de ensaio num suporte (Fig.9 a). Ver Fig.1 para recomendações sobre os volumes a recolher em cada tubo de ensaio.20) Quando o primeiro tubo de ensaio estiver cheio, ou se tiver sido recolhida uma determinada altura de líquido, conforme recomendado pelo seu instrutor ou pela Fig. 1, mova o suporte para iniciar a recolha num tubo diferente (Fig. 9 b e c). Encha e mantenha os tubos por ordem no suporte.
Estes tubos diferentes são designados por "fracções". O objetivo de uma coluna é recolher fracções suficientemente pequenas para que a maioria (ou algumas) das fracções contenham material puro. Se a separação da mistura for difícil (se o ΔRf dos componentes for baixo), pode ser melhor recolher pequenas fracções (por exemplo, tubos meio cheios).
Estes tubos diferentes são designados por "fracções". O objetivo de uma coluna é recolher fracções suficientemente pequenas para que a maioria (ou algumas) das fracções contenham material puro. Se a separação da mistura for difícil (se o ΔRf dos componentes for baixo), pode ser melhor recolher pequenas fracções (por exemplo, tubos meio cheios).
a-c) Material de lavagem salpicado para a ponta da coluna, d) Estudantes a fazer funcionar uma coluna
21) À medida que o líquido escorre da coluna, salpica frequentemente para o exterior da ponta da coluna e, quando o solvente evapora, pode ver um anel de material na ponta (verá um anel de sólido se o componente for um sólido, como na Fig. 10 b, ou gotículas oleosas se o componente for um líquido). Se os componentes forem coloridos, a ponta da coluna deve ser enxaguada (Fig. 10 c) quando parecer que um componente foi completamente eluído e antes de o outro componente se aproximar.
22) Controlar periodicamente o nível do eluente e voltar a encher antes que este desça abaixo da camada de areia.
22) Controlar periodicamente o nível do eluente e voltar a encher antes que este desça abaixo da camada de areia.
a) Eluição, b) Adição de acetato de etilo para aumentar a polaridade do solvente, c) O nível do solvente aproxima-se da camada de areia, d) Reenchimento
Possível aumento da polaridade do solvente
23) Pode ser utilizado um eluente em toda a coluna, especialmente se os componentes a separar tiverem valores Rf semelhantes. No entanto, se os componentes tiverem valores Rf muito diferentes, a polaridade do solvente pode ser aumentada depois de um componente ter sido eluído da coluna (Fig.11 a).
O aumento da polaridade do solvente fará com que os componentes se desloquem "mais depressa". Há várias razões para se desejar uma eluição mais rápida. Em primeiro lugar, se um componente já tiver saído da coluna, a coluna já fez o seu trabalho de separação, pelo que acelerar o processo não afectará a pureza das fracções recolhidas. Em segundo lugar, quanto mais tempo demorar a coluna, mais largas serão as bandas dos componentes (devido à difusão) e a recolha de uma banda larga de material irá utilizar (e desperdiçar) muito solvente.
O aumento da polaridade do solvente fará com que os componentes se desloquem "mais depressa". Há várias razões para se desejar uma eluição mais rápida. Em primeiro lugar, se um componente já tiver saído da coluna, a coluna já fez o seu trabalho de separação, pelo que acelerar o processo não afectará a pureza das fracções recolhidas. Em segundo lugar, quanto mais tempo demorar a coluna, mais largas serão as bandas dos componentes (devido à difusão) e a recolha de uma banda larga de material irá utilizar (e desperdiçar) muito solvente.
Contém uma lista parcial da série eluotrópica, uma lista de solventes comuns classificados de acordo com o seu "poder solvente" em cromatografia de fase normal. O solvente mais polar causa o aumento mais dramático no Rf
24) Para aumentar a polaridade do solvente, o solvente polar pode ser gotejado diretamente no eluente no reservatório da coluna (Fig. 11 b). Por exemplo, se se utilizar uma mistura de hexanos:acetato de etilo, a adição de acetato de etilo puro ao eluente atualmente no reservatório aumentará a sua polaridade. Se o nível do eluente estiver a ficar baixo, pode preparar-se uma solução que contenha uma maior percentagem do componente mais polar. Por exemplo, se a coluna utilizou primeiro uma mistura 4:1 de hexanos:acetato de etilo, utilizar uma mistura 1:1 seria um solvente mais polar.
25) Eluir a coluna com o solvente mais polar como anteriormente, e lembrar-se sempre de observar o nível do eluente e voltar a encher (Fig. 11 d) antes que desça abaixo da camada de areia.
26) Para aumentar a polaridade do solvente, o solvente polar pode ser gotejado diretamente para o eluente no reservatório da coluna (Fig. 11 b). Por exemplo, se se utilizar uma mistura de hexanos:acetato de etilo, a adição de acetato de etilo puro ao eluente atualmente no reservatório aumentará a sua polaridade. Se o nível do eluente estiver a ficar baixo, pode preparar-se uma solução que contenha uma maior percentagem do componente mais polar. Por exemplo, se a coluna utilizou primeiro uma mistura 4:1 de hexanos:acetato de etilo, utilizar uma mistura 1:1 seria um solvente mais polar.
27) Eluir a coluna com o solvente mais polar como anteriormente e lembrar-se sempre de observar o nível do eluente e voltar a encher (Fig.11 d) antes que desça abaixo da camada de areia.
25) Eluir a coluna com o solvente mais polar como anteriormente, e lembrar-se sempre de observar o nível do eluente e voltar a encher (Fig. 11 d) antes que desça abaixo da camada de areia.
26) Para aumentar a polaridade do solvente, o solvente polar pode ser gotejado diretamente para o eluente no reservatório da coluna (Fig. 11 b). Por exemplo, se se utilizar uma mistura de hexanos:acetato de etilo, a adição de acetato de etilo puro ao eluente atualmente no reservatório aumentará a sua polaridade. Se o nível do eluente estiver a ficar baixo, pode preparar-se uma solução que contenha uma maior percentagem do componente mais polar. Por exemplo, se a coluna utilizou primeiro uma mistura 4:1 de hexanos:acetato de etilo, utilizar uma mistura 1:1 seria um solvente mais polar.
27) Eluir a coluna com o solvente mais polar como anteriormente e lembrar-se sempre de observar o nível do eluente e voltar a encher (Fig.11 d) antes que desça abaixo da camada de areia.
a) Placa de TLC original, b) Fracções recolhidas pela coluna, c) Colocação das fracções numa placa de TLC, d) Uma placa de TLC visualizada com amostras de cada fração
Encontrar e Concentrar o Componente Desejado
28) Para encontrar o componente desejado nas fracções do tubo de ensaio, é útil compreender a relação entre Rf e a ordem de eluição na cromatografia em coluna.Na cromatografia em coluna, a amostra é depositada à frente da coluna e eluída para baixo, enquanto na cromatografia em camada fina, a amostra é colocada no fundo da placa e eluída para cima. Por conseguinte, uma coluna pode ser considerada como uma placa TLC invertida. Um composto com um Rf mais elevado corre "mais depressa", o que significa que acaba por ficar mais alto numa placa de TLC e será recolhido primeiro com uma coluna. Na coluna ilustrada nesta secção, o componente com o Rf mais baixo (laranja na placa TLC na Fig.13 a) é o componente recolhido em segundo lugar na coluna.
29) Determinar primeiro quais os tubos de ensaio que contêm o composto dissolvido.
29) Determinar primeiro quais os tubos de ensaio que contêm o composto dissolvido.
a) Colocar uma amostra de cada fração numa placa de TLC rotulada com os números das fracções correspondentes à ordem em que foram recolhidas (Fig. 13 c). Pode ser melhor colocar cada amostra 2 a 3 vezes uma sobre a outra, caso as fracções estejam diluídas.
b) Se tiverem sido recolhidas muitas fracções, o que o torna hesitante em colher amostras de todas as fracções, um método para identificar as fracções incolores que podem conter composto é procurar um vestígio de resíduo que conduza os tubos de ensaio. Após a evaporação, um resíduo sólido (Fig.13) ou gotículas oleosas são por vezes deixados no topo do tubo de ensaio, tornando óbvio que essas fracções contêm mais do que apenas solvente. Colher amostras de todas as fracções perto dos tubos que contêm resíduos visíveis.
c) Visualize a placa de TLC manchada utilizando luz UV e/ou um corante para determinar quais as fracções que contêm o composto (Fig. 13 d)
a) Placas TLC eluídas de fracções contendo o possível composto, b) Combinação de fracções, c) Lavagem de um tubo de fração
28) Efetuar um TLC de todas as fracções que contenham o composto, identificando até cinco amostras por placa de TLC de 2,5 cm de largura. Podem ser utilizadas placas TLC mais largas para este efeito, se disponíveis.
29) Identificar o composto com o Rf desejado por comparação com a placa de TLC original em bruto. Optar por reter as fracções que contêm o composto desejado na forma pura, tal como evidenciado pela placa de TLC eluída. Por exemplo, se o composto com o Rf mais elevado for desejado na Fig.15 a, as fracções 6-10 devem ser mantidas.
30) Juntar as fracções puras num balão de fundo redondo de tamanho adequado (não mais de metade do volume, Fig.15 b). Enxaguar cada tubo de ensaio com uma pequena quantidade de eluente (ou outro solvente se a solubilidade for um problema) e adicionar o enxaguamento ao balão de fundo redondo (Fig. 15 c).
31) Evaporar o solvente no evaporador rotativo para deixar o composto purificado no balão.
29) Identificar o composto com o Rf desejado por comparação com a placa de TLC original em bruto. Optar por reter as fracções que contêm o composto desejado na forma pura, tal como evidenciado pela placa de TLC eluída. Por exemplo, se o composto com o Rf mais elevado for desejado na Fig.15 a, as fracções 6-10 devem ser mantidas.
30) Juntar as fracções puras num balão de fundo redondo de tamanho adequado (não mais de metade do volume, Fig.15 b). Enxaguar cada tubo de ensaio com uma pequena quantidade de eluente (ou outro solvente se a solubilidade for um problema) e adicionar o enxaguamento ao balão de fundo redondo (Fig. 15 c).
31) Evaporar o solvente no evaporador rotativo para deixar o composto purificado no balão.
a) Utilizar a pressão do ar para secar a coluna, b) Deixar a coluna secar de cabeça para baixo, c) Recolher os resíduos de sílica
Limpeza da coluna
32) Para secar a coluna, aplique pressão de ar para drenar a maior parte do eluente da coluna para um recipiente de resíduos. Em seguida, continuar a secar a coluna utilizando um dos seguintes métodos.
a) Deixar ligado um fluxo suave de ar que atravessa a coluna para a secar enquanto limpa outras coisas (Fig.16 a).
b) Fixar a coluna de cabeça para baixo sobre um grande copo de resíduos na hotte, de modo a que o adsorvente caia quando estiver seco (Fig. 16 b). Isto demora muito tempo (até ao período de aulas seguinte), mas é uma opção.
33) Quando estiver seco, o adsorvente pode ser despejado da coluna para um contentor de resíduos na hotte (Fig.16 c).
Nota de segurança: Os adsorventes em pó são irritantes para os pulmões, e o seu perigo é exacerbado se a coluna contiver compostos residuais que podem agora entrar nos pulmões. O derrame de pós de sílica ou alumina deve ser sempre efectuado na hotte.
34) Quando a maior parte do adsorvente tiver sido recolhida num recipiente de resíduos, utilizar água para enxaguar qualquer resíduo sólido no lavatório e, em seguida, enxaguar a coluna com acetona para um copo de resíduos. Depois, limpe a coluna com água e sabão e seque-a com as peças da torneira separadas.
Nota de segurança: Os adsorventes em pó são irritantes para os pulmões, e o seu perigo é exacerbado se a coluna contiver compostos residuais que podem agora entrar nos pulmões. O derrame de pós de sílica ou alumina deve ser sempre efectuado na hotte.
34) Quando a maior parte do adsorvente tiver sido recolhida num recipiente de resíduos, utilizar água para enxaguar qualquer resíduo sólido no lavatório e, em seguida, enxaguar a coluna com acetona para um copo de resíduos. Depois, limpe a coluna com água e sabão e seque-a com as peças da torneira separadas.
Resolução de problemas
Observam-se bolhas de ar na coluna
Uma bolha de ar é uma bolsa vazia onde não ocorre o equilíbrio entre a fase estacionária e a fase móvel, pelo que os componentes se movem mais rapidamente do que deveriam numa bolha de ar. Isto pode levar a bandas de eluição desiguais, o que pode causar sobreposição se a separação da mistura for difícil (se os componentes tiverem valores Rf muito próximos, como na Fig.17).
Se forem observadas bolhas de ar na coluna e se a areia ou a amostra ainda não tiverem sido aplicadas, dar à coluna uma boa sacudidela durante o empacotamento para remover todas as bolhas de ar. Se as bolhas não desaparecerem, consulte o seu instrutor, pois poderá estar a abordar a tarefa de forma demasiado delicada. Se a areia ou a amostra já tiver sido aplicada, é melhor deixar a coluna como está e esperar que as bolhas de ar não afectem a separação.
As bandas estão a eluir de forma desigual
Se os componentes de uma mistura forem coloridos, pode ser óbvio quando as bandas eluem de forma torta. Isto deve-se muito provavelmente ao facto de a coluna estar fixada numa ligeira diagonal. Se a coluna for fixada de forma inclinada, os componentes deslocar-se-ão de forma inclinada (Fig. 18). Isto pode causar problemas de separação se os componentes tiverem um Rf semelhante.
Não há forma de resolver este problema a meio de uma coluna, mas se os componentes tiverem valores de Rf muito diferentes, as bandas inclinadas podem não ter qualquer efeito na separação. No futuro, certifique-se de que a coluna está perfeitamente vertical nas direcções lado a lado e frente-atrás.
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