Le metodologie Crispr, pur essendo utili e molto semplici da usare per gli iniziati, sono ancora molto complesse. Ha esperienza di biologia sintetica? Conoscete i diversi elementi presenti in un gene che ne determinano l'intensità e le condizioni di espressione? Cosa sapete del codice genetico, dell'ottimizzazione dei codoni, della progettazione dei primer, dei vettori di clonazione e di espressione, della struttura del complesso CRISPR-Cas9? Non si tratta di parole a caso, ma di concetti che dovrete padroneggiare a fondo prima di trasfettare con successo una cellula di mammifero, per non parlare della vostra.
Per ottenere un gene desiderato, dovrete innanzitutto trovare la sua sequenza in un database di geni, molto semplice e disponibile gratuitamente online, nonché un promotore adatto, incollare questi due elementi insieme a primer PCR (con siti di restrizione per la digestione da parte degli enzimi di restrizione) e inviare il tutto a un'azienda di sintesi di DNA personalizzato. Ce ne sono diverse, alcune sono molto più economiche di altre.
Altrimenti, si potrebbe acquistare solo il filamento del promotore e ottenere il gene di interesse tramite PCR da una fonte naturale o acquistare direttamente il gene se si tratta di un gene comune come il sistema della luciferasi (ma perché si dovrebbe voler brillare al buio lol).
Quindi è possibile inserirlo in un plasmide CRISPR e in un filamento guida appropriato per indirizzare una posizione specifica nel genoma.
Potete cercare il canale youtube "the thought emporium" che ha fatto un esperimento del genere su se stesso, ma PER FAVORE fate una ricerca sul vostro progetto per ALMENO UN PO' DI ANNI prima di portarlo a termine.