Bevezetés
Az oszlopkromatográfia a vékonyréteg-kromatográfia (TLC) kiterjesztése. Feltételezzük, hogy az olvasó rendelkezik némi tapasztalattal a laboratóriumi gyakorlatban, és foglalkozott már vékonyréteg-kromatográfiával. Ahelyett, hogy a mintát egy vékony szilícium-dioxid- vagy alumínium-oxid-rétegre helyeznénk, a mintát egy adszorbens-hengerre helyezzük, és az oldószert folyamatosan nyomással addig adagoljuk, amíg a komponensek teljesen ki nem ürülnek a hengerből. Ezzel a módosítással a komponensek nemcsak elválaszthatók, hanem különböző tartályokba is gyűjthetők, lehetővé téve keverékek tisztítását és a szennyezett gyógyszerek elkülönítését. Az oszlopkromatográfiát (más néven "flash-kromatográfiát") gyakran használják kutatási környezetben, amit a folyóiratcikkek eljárási részlegeiben való gyakori előfordulása is bizonyít.
Eljárási megbeszélés
Az oszlopkromatográfiára ugyanazok a vékonyréteg-kromatográfia (TLC) alapelvei vonatkoznak. Valójában az oszlopkromatográfia elvégzése előtt mindig lefuttatnak egy TLC-t, hogy felmérjék a helyzetet és meghatározzák a megfelelő oldószerarányt. A jó elválasztás érdekében ideális, ha a kívánt komponens Rf értéke 0,35 körül van (az Rf-ről a TLC témakörben olvashat), és legalább 0,2 Rf egységgel van elválasztva a többi komponenstől. Ha az elválasztandó foltok nagyon közel vannak egymáshoz (ha az Rf különbség < 0,2), akkor a legjobb, ha a foltok közepe 0,35-ös Rf-fel rendelkezik. A 0,35 közeli Rf ideális, mert elég lassú ahhoz, hogy az álló-mozgó fázis kiegyenlítődése megtörténhessen, de elég gyors ahhoz, hogy a diffúzióból eredő sávszélesedés minimálisra csökkenjen.
Van néhány olyan változó, amely nem alkalmazható a TLC-re, de befolyásolja a komponensek elválasztását oszlopkromatográfiában. Ezek közé tartozik az oszlop átmérője, a felhasznált adszorbens mennyisége és az oldószer áramlási sebessége. Kép. 1 mutatja a változó ajánlásokat a minta mérete és a komponensek közötti elválasztás mértéke alapján. Az oszlopokat minden esetben 12,5-15 cm magasság között kell előkészíteni.
Van néhány olyan változó, amely nem alkalmazható a TLC-re, de befolyásolja a komponensek elválasztását oszlopkromatográfiában. Ezek közé tartozik az oszlop átmérője, a felhasznált adszorbens mennyisége és az oldószer áramlási sebessége. Kép. 1 mutatja a változó ajánlásokat a minta mérete és a komponensek közötti elválasztás mértéke alapján. Az oszlopokat minden esetben 12,5-15 cm magasság között kell előkészíteni.
Például egy 2,5 cm-es oszlopnak körülbelül 400 mg anyag tisztítására kell alkalmasnak lennie, ha az elválasztás jó (ΔRf > 0,2, harmadik oszlop az 1. ábrán), vagy körülbelül 160 mg-ra, ha az elválasztás nehéz (ΔRf > 0,1). Az oszlopot körülbelül 200 ml oldószerrel kell elkészíteni és eluálni, és a frakciókat körülbelül egyenként 10 ml oldattal lehet összegyűjteni.
Az oszlop fizikai futtatásának többféle változata létezik. Az egyik nagy különbség a módszerek között az oszlop előkészítésének módja. A "dry packing" módszer során száraz szilícium-dioxidot vagy alumínium-oxidot adnak közvetlenül az oszlophoz, és hagyják, hogy az oldószer adagokban, majd nyomás alatt átcsorogjon rajta. A "nedves töltés" módszerénél az oszlopot először oldószerrel töltik meg, majd száraz szilícium-dioxidot vagy timföldet ráznak bele, és nyomás alatt töltik meg. Az "iszapos" módszerben az oldószert egy Erlenmeyer-lombikban a szilícium-dioxidhoz vagy timföldhöz adjuk, iszapos anyagként az oszlopra öntjük, majd nyomással töltjük (a nyomás fecskendővel is előállítható).
Fontos tudni, hogy az oldószer szilícium-dioxidhoz vagy timföldhöz történő hozzáadásakor hő szabadul fel (exoterm oldódási hővel rendelkeznek). Ebben a fejezetben az iszapos módszert mutatjuk be, amelynek fő oka az, hogy ez az exoterm lépés az oszlop helyett egy Erlenmeyer-lombikban történik. Ha az oszlop pakolása során hő szabadul fel, akkor az oldószer forrásából buborékok keletkezhetnek. Ezek zavarhatják az oszlop elválasztását, ha nem távolítják el őket megfelelően, és megrepeszthetik az oszlopban lévő adszorbens anyagot.
Az oszlop fizikai futtatásának többféle változata létezik. Az egyik nagy különbség a módszerek között az oszlop előkészítésének módja. A "dry packing" módszer során száraz szilícium-dioxidot vagy alumínium-oxidot adnak közvetlenül az oszlophoz, és hagyják, hogy az oldószer adagokban, majd nyomás alatt átcsorogjon rajta. A "nedves töltés" módszerénél az oszlopot először oldószerrel töltik meg, majd száraz szilícium-dioxidot vagy timföldet ráznak bele, és nyomás alatt töltik meg. Az "iszapos" módszerben az oldószert egy Erlenmeyer-lombikban a szilícium-dioxidhoz vagy timföldhöz adjuk, iszapos anyagként az oszlopra öntjük, majd nyomással töltjük (a nyomás fecskendővel is előállítható).
Fontos tudni, hogy az oldószer szilícium-dioxidhoz vagy timföldhöz történő hozzáadásakor hő szabadul fel (exoterm oldódási hővel rendelkeznek). Ebben a fejezetben az iszapos módszert mutatjuk be, amelynek fő oka az, hogy ez az exoterm lépés az oszlop helyett egy Erlenmeyer-lombikban történik. Ha az oszlop pakolása során hő szabadul fel, akkor az oldószer forrásából buborékok keletkezhetnek. Ezek zavarhatják az oszlop elválasztását, ha nem távolítják el őket megfelelően, és megrepeszthetik az oszlopban lévő adszorbens anyagot.
Lépésről lépésre történő eljárások
ábra
a) A ferrocén/acetilferrocén keverék TLC-je, b) Oszlopkromatográfia
a) A ferrocén/acetilferrocén keverék TLC-je, b) Oszlopkromatográfia
Az itt látható oszlopon egy 0,20 g ferrocén és acetil-ferrocén keveréket tartalmazó minta tisztítása látható (a nyers TLC a 2. a) ábrán). Nagyjából 8 ml frakciókat gyűjtöttünk kis kémcsövekbe, és nagyjából 400 ml eluens került felhasználásra.
a) TLC lemez a nyers ferrocén/acetilferrocén keverékből elúció előtt, b) Elúció után, c) oszlop fritttel, d) oszlop az aljába ékelt vattával, e) oszlop a vatta ék nélkül (használat előtt be kell helyezni).
Futtasson egy TLC-t
1) Futtasson TLC-t a tisztítandó mintán (3. a és b ábra) a kromatográfiához megfelelő oldószer meghatározásához. A kívánt komponensnek 0,35 körüli Rf értékkel kell rendelkeznie, és ideális esetben legalább 0,2 Rf egységgel kell elválasztani az összes többi foltot.
2) Készítsen egy olyan adag eluálószert, amely a megfelelő Rf-értéket adja. Az elkészített mennyiség függ a minta mennyiségétől, az oszlop méretétől, és attól, hogy tervezik-e az oldószer összetételének módosítását félúton. (Lásd az 1. ábrán az irányelveket és az eluotropikus sorozatot az "oldószer teljesítményének" tendenciáihoz).
2) Készítsen egy olyan adag eluálószert, amely a megfelelő Rf-értéket adja. Az elkészített mennyiség függ a minta mennyiségétől, az oszlop méretétől, és attól, hogy tervezik-e az oldószer összetételének módosítását félúton. (Lásd az 1. ábrán az irányelveket és az eluotropikus sorozatot az "oldószer teljesítményének" tendenciáihoz).
A töltött oszlop előkészítése
3) Szerezzen be egy megfelelő oszlopot (lásd az 1. ábrát), és győződjön meg róla, hogy a csap közelében van valami, ami átengedi a folyadékot, de nem engedi át a szilárd anyagot. Az oszlopok lehetnek szinterezett koronggal (más néven "frit), 3. ábra c), vagy az előző felhasználótól megmaradt vatta- vagy üveggyapot-dugóval (3. ábra d). Ha nincs korong vagy dugó (3. ábra e), akkor egy hosszú rúddal ékeljünk egy kis vatta- vagy üveggyapotot az oszlop aljába.
ábra
a) A szilícium-dioxid beöntése 12,5-15 cm magasra a füstgázszekrényben, b) A szilícium-dioxid beöntése egy Erlenmeyer-lombikba, c és d) A szuszpenzió készítése.
a) A szilícium-dioxid beöntése 12,5-15 cm magasra a füstgázszekrényben, b) A szilícium-dioxid beöntése egy Erlenmeyer-lombikba, c és d) A szuszpenzió készítése.
Biztonsági megjegyzés: A porított szilícium-dioxid és timföld a tüdőt irritáló anyagok, ezért mindig óvatosan kell kezelni őket a füstgázelszívóban. A kiömlött port nedves papírtörlővel való felmosással kell ártalmatlanítani (ha nedves, a finom részecskék kevésbé oszlanak el).
5 ) A füstelszívóban öntse az oszlopban kimért adszorbenst egy Erlenmeyer-lombikba (4. ábra b), majd adjon hozzá némi eluens (4. ábra c). Készítsen laza iszapot egy üveg keverőpálcával történő kavargatással és keveréssel (4. ábra d), amíg az összes adszorbens teljesen átnedvesedik, a gázbuborékok felszabadulnak, és az állaga kissé sűrű, de önthető.
ábra
a) Az iszapnak az oszlopba öntése, b) A lombik öblítése, c) Az oszlop oldalára tapadt adszorbens, d) A megtapadt adszorbens leöblítése.
a) Az iszapnak az oszlopba öntése, b) A lombik öblítése, c) Az oszlop oldalára tapadt adszorbens, d) A megtapadt adszorbens leöblítése.
6) Helyezzen egy főzőpoharat vagy Erlenmeyer-lombikot a beszorított oszlop alá, és nyissa ki a csapot. Egyetlen gyors mozdulattal kavarja fel és öntse a szilícium-dioxid- vagy timföld-iszapot az oszlopba egy nagy szájú tölcsér segítségével (5. ábra a). Azonnal használjon több eluens oldatot, hogy a maradék iszapot kiöblítse az Erlenmeyer-lombikból (5. ábra b) és az oszlopra.
7) Azonnal öblítse le a szilícium-dioxidot vagy timföldet az oszlop tartályának oldaláról eluenssel és egy Pasteur-pipetta kavaró mozgásával (5. ábra c és d). Ha hagyja megszáradni, az adszorbens az üveghez tapad, és nem lesz könnyen leöblíthető.
7) Azonnal öblítse le a szilícium-dioxidot vagy timföldet az oszlop tartályának oldaláról eluenssel és egy Pasteur-pipetta kavaró mozgásával (5. ábra c és d). Ha hagyja megszáradni, az adszorbens az üveghez tapad, és nem lesz könnyen leöblíthető.
a) Az oszlop lökdösése a légbuborékok eltávolítása érdekében, b) A légnyomás alkalmazása, c) A homok hozzáadása, d) A homok leöblítése az oldalról.
8) Rázza meg erősen az oszlopot egy parafagyűrű vagy az ujjpercek segítségével (6. ábra a), hogy eltávolítsa az oszlopban lévő légbuborékokat (amelyek az adszorbens rossz elválását vagy repedezését okozhatják az oszlopban), és elősegítse az adszorbens egyenletes lerakódását.
9) Gyengéd légnyomást alkalmazzon az oszlop tetejére (6. ábra b), hogy összenyomja azt, és hagyja abba, amikor az eluens szintje 1 cm-re van az oszlop tetejétől. Ha T-adaptert használunk a légvezetékkel, mint a 6. b ábrán, a légáramlás finom szabályozása a gumicsövön lévő szorítóbilincs beállításával érhető el. Az egész eluálási folyamat során tartsa a fehér adszorbensoszlopot nedvesen, az eluens szintje a szilícium-dioxid vagy timföld felső része fölött legyen. Óvatosan törje fel a tömítést a nyomás alkalmazásának megszüntetéséhez, és zárja le a csapot, hogy megakadályozza a folyadék további kicsöpögését.
10) Adjunk hozzá egy vékony, körülbelül 0,5 cm magas homokréteget (6. ábra c). Öblítse át az oszlop oldalait eluenssel, és örvénylő mozdulatokkal távolítsa el a homokot az üveg oldaláról (6. ábra d). Nyissa ki a csapot, és hagyja, hogy a folyadék kifolyjon, amíg a folyadék éppen a homokréteg fölé nem kerül. Ha a csepegés túl lassú, alkalmazzon légnyomást.
9) Gyengéd légnyomást alkalmazzon az oszlop tetejére (6. ábra b), hogy összenyomja azt, és hagyja abba, amikor az eluens szintje 1 cm-re van az oszlop tetejétől. Ha T-adaptert használunk a légvezetékkel, mint a 6. b ábrán, a légáramlás finom szabályozása a gumicsövön lévő szorítóbilincs beállításával érhető el. Az egész eluálási folyamat során tartsa a fehér adszorbensoszlopot nedvesen, az eluens szintje a szilícium-dioxid vagy timföld felső része fölött legyen. Óvatosan törje fel a tömítést a nyomás alkalmazásának megszüntetéséhez, és zárja le a csapot, hogy megakadályozza a folyadék további kicsöpögését.
10) Adjunk hozzá egy vékony, körülbelül 0,5 cm magas homokréteget (6. ábra c). Öblítse át az oszlop oldalait eluenssel, és örvénylő mozdulatokkal távolítsa el a homokot az üveg oldaláról (6. ábra d). Nyissa ki a csapot, és hagyja, hogy a folyadék kifolyjon, amíg a folyadék éppen a homokréteg fölé nem kerül. Ha a csepegés túl lassú, alkalmazzon légnyomást.
Adjuk hozzá a mintát
Amint a minta az oszlopra kerül, versenyfutás kezdődik az idővel, mivel a diffúzió elkezdi kiszélesíteni az anyagot. A mintát nem szabad addig felhordani, amíg nem áll készen arra, hogy az oszlopot azonnal és teljes egészében befejezze. Ez a folyamat 15 és 90 perc között lehet! Ha kémcsöveket használ a frakciók gyűjtéséhez, a minta hozzáadása előtt a kémcsöveket egy állványba kell helyezni, és az oszlop magasságát úgy kell beállítani, hogy a kémcsőállvány alá lehessen csúsztatni.
a) Egy szilárd anyag feloldása kis mennyiségű diklórmetánnal, b) A minta felhordása, c) A minta öblítése a lombikban, d) Nyomás alkalmazása a minta oszlopra nyomásához, közvetlenül a homokréteg után.
11) Ha a nyers minta folyadék, közvetlenül használjuk fel (folytassuk a 13. lépéssel).
12) Ha a nyers minta szilárd anyag, tegye meg a következő műveletek egyikét.
12) Ha a nyers minta szilárd anyag, tegye meg a következő műveletek egyikét.
a) Ideális helyzet: oldja fel a szilárd anyagot az eluens minimális mennyiségében (legfeljebb néhány ml).
b) Ha a szilárd anyag nem különösebben oldódik, vagy nem oldódik fel néhány ml eluensben, oldjuk fel a minimális mennyiségű diklórmetánban (legfeljebb néhány ml, 7. ábra a).
c) Ha a szilárd anyag nem oldódik az eluensben, alternatív eljárás is lehetséges. Oldjuk fel a szilárd anyagot egy kerekfenekű lombikban néhány ml alacsony forráspontú oldószerrel (pl. diklórmetán vagy aceton). Adjunk a lombikhoz kb. 1 g szilícium-dioxidot vagy alumínium-oxidot, majd rotációs elpárologtatóval távolítsuk el az oldószert, hogy az adszorbensre lerakódott mintát tartalmazó szilárd anyag maradjon. A töltött oszlop tetején egy hüvelyknyi eluens áll (ha ezt a módszert alkalmazzuk, hagyjuk ki a homokréteg hozzáadását), és széles szájú tölcsér segítségével öntsük a szilícium-dioxiddal adszorbeált mintát az oszlopra. Ha por tapad az üvegre, öblítse le további eluenssel (folytassa a 15. lépéssel).
13) Finoman adagolja a mintát az oszlophoz pipettával, a folyadékot vagy oldatot a pipetta hegyével közvetlenül a homokra csepegtesse, amennyire csak tudja, ne az oldalára (7. ábra b). Ügyeljünk arra, hogy ne spricceljük a folyadékot erőszakosan, hogy ne keletkezzenek bemélyedések a homokban vagy a szilícium-dioxid/alumínium-dioxid oszlopban.
14) Öblítse ki a mintatartályt egy kevés oldószerrel (vagy diklórmetánnal, ha használ, 7. ábra c), és az öblítést ugyanazzal a pipettával adja az oszlophoz (hogy a pipettát is átöblítse).
15) Nyissa ki a csapot, és hagyja, hogy a folyadék addig csöpögjön, amíg a minta éppen csak túljut a homokrétegen (7. ábra d) és az oszlop fehér területére (alkalmazzon légnyomást, ha ez több mint 20 másodpercig tart).
16 ) Óvatosan, kavaró mozdulatokkal öblítse át az oszlop oldalait 1-2 pipettányi eluenssel, hogy a kifröccsent mintát leöblítse. Ismét hagyja, hogy a folyadék kicsöpögjön (vagy alkalmazzon légnyomást), amíg a minta be nem nyomódik a fehér adszorbensbe.
Ismételje meg az öblítési lépést addig, amíg meg nem győződik arról, hogy a teljes minta az adszorbensre került. Ha a minta egy része még mindig a homokrétegben van, akkor az további oldószer hozzáadásakor feloldódhat az eluensben, ami a hozam csökkenéséhez vezethet. Ha a vegyület színes, az öblítésnek teljesen tisztának kell lennie.
14) Öblítse ki a mintatartályt egy kevés oldószerrel (vagy diklórmetánnal, ha használ, 7. ábra c), és az öblítést ugyanazzal a pipettával adja az oszlophoz (hogy a pipettát is átöblítse).
15) Nyissa ki a csapot, és hagyja, hogy a folyadék addig csöpögjön, amíg a minta éppen csak túljut a homokrétegen (7. ábra d) és az oszlop fehér területére (alkalmazzon légnyomást, ha ez több mint 20 másodpercig tart).
16 ) Óvatosan, kavaró mozdulatokkal öblítse át az oszlop oldalait 1-2 pipettányi eluenssel, hogy a kifröccsent mintát leöblítse. Ismét hagyja, hogy a folyadék kicsöpögjön (vagy alkalmazzon légnyomást), amíg a minta be nem nyomódik a fehér adszorbensbe.
Ismételje meg az öblítési lépést addig, amíg meg nem győződik arról, hogy a teljes minta az adszorbensre került. Ha a minta egy része még mindig a homokrétegben van, akkor az további oldószer hozzáadásakor feloldódhat az eluensben, ami a hozam csökkenéséhez vezethet. Ha a vegyület színes, az öblítésnek teljesen tisztának kell lennie.
a és b) Az oldószertartály feltöltése, c és d) Az oszlop eluálása.
Töltse fel az eluenssel és eluálja az oszlopot
17) Finoman adagoljon további eluenset pipettával (8. a) ábra), az oldalfalakon lefelé kavargatva, majd amikor a homokréteget már nem zavarja a hozzáadás, óvatosan öntsön nagyobb mennyiséget (8. b) az előkészített eluensből, hogy a tartály megteljen (vagy töltsön fel annyit, amennyire szükség lehet). Az oszlop töltése során összegyűjtött tiszta eluens újra felhasználható.
18 ) Légnyomással óvatosan és egyenletesen eluálja a mintát az oszlopon keresztül (8. ábra c és d). Minél többször indítjuk el és állítjuk le a nyomást, annál valószínűbb, hogy az oszlop megrepedhet. A legjobb, ha a nyomást végig finoman és egyenletesen lehet tartani.
Az optimális csepegési sebesség az elúció során az oszlop méretétől függ. Az ideális eluens áramlása az, amikor az oldószer az oszlop hengeres szakaszában az adszorbens felett percenként 5 cm-rel csepeg. Ezért a csepegési sebességnek keskeny oszlop esetén lassabbnak kell lennie, mint szélesebb oszlop esetén. A csepegési sebességnek egy hüvelykes oszlop esetében olyan mértékűnek kell lennie, ahol az egyes cseppek alig különböztethetők meg. Az ilyen méretű oszlopnál a csapból kiömlő folyadékáram kissé túl gyors.
18 ) Légnyomással óvatosan és egyenletesen eluálja a mintát az oszlopon keresztül (8. ábra c és d). Minél többször indítjuk el és állítjuk le a nyomást, annál valószínűbb, hogy az oszlop megrepedhet. A legjobb, ha a nyomást végig finoman és egyenletesen lehet tartani.
Az optimális csepegési sebesség az elúció során az oszlop méretétől függ. Az ideális eluens áramlása az, amikor az oldószer az oszlop hengeres szakaszában az adszorbens felett percenként 5 cm-rel csepeg. Ezért a csepegési sebességnek keskeny oszlop esetén lassabbnak kell lennie, mint szélesebb oszlop esetén. A csepegési sebességnek egy hüvelykes oszlop esetében olyan mértékűnek kell lennie, ahol az egyes cseppek alig különböztethetők meg. Az ilyen méretű oszlopnál a csapból kiömlő folyadékáram kissé túl gyors.
a-c) Frakciók gyűjtése, d) Egy oszlop futtatása
Frakciók gyűjtése
19) Azonnal kezdje el az eluáló folyadékot egy állványon lévő kémcsövekbe gyűjteni (9. a) ábra). Lásd az 1. ábrát az egyes kémcsövekbe gyűjtendő mennyiségekre vonatkozó ajánlásokért.20) Amikor az első kémcső megtelik, vagy ha az oktató vagy az 1. ábra ajánlásának megfelelően egy bizonyos magasságú folyadékot gyűjtöttünk, toljuk át az állványt, hogy elkezdjük a gyűjtést egy másik kémcsőbe (9. ábra b és c). Töltse meg és tartsa a csöveket sorrendben az állványon.
Ezeket a különböző csöveket "frakcióknak" nevezzük. Az oszlop célja, hogy elég kis frakciókat gyűjtsön, hogy a legtöbb (vagy néhány) frakció tiszta anyagot tartalmazzon. Ha a keverék elválasztása nehéz (ha a komponensek ΔRf értéke alacsony), akkor a legjobb lehet, ha kis frakciókat gyűjtünk (pl. félig töltött csöveket).
Ezeket a különböző csöveket "frakcióknak" nevezzük. Az oszlop célja, hogy elég kis frakciókat gyűjtsön, hogy a legtöbb (vagy néhány) frakció tiszta anyagot tartalmazzon. Ha a keverék elválasztása nehéz (ha a komponensek ΔRf értéke alacsony), akkor a legjobb lehet, ha kis frakciókat gyűjtünk (pl. félig töltött csöveket).
ábra
a-c) Az oszlop csúcsára fröccsent öblítőanyag, d) Az oszlopot futtató diákok.
a-c) Az oszlop csúcsára fröccsent öblítőanyag, d) Az oszlopot futtató diákok.
21) Ahogy a folyadék lefolyik az oszlopról, gyakran az oszlop csúcsának külső oldalaira fröccsen, és amikor az oldószer elpárolog, az oszlop csúcsán egy anyaggyűrűt láthatunk (szilárd anyaggyűrűt, ha a komponens szilárd, mint a 10. b ábrán, vagy olajos cseppeket, ha a komponens folyadék). Ha a komponensek színesek, az oszlopcsúcsot akkor kell kiöblíteni (10. ábra c), amikor úgy tűnik, hogy az egyik komponens teljesen eluálódott, és mielőtt a másik komponens megközelítené.
22) Rendszeresen tartsa szemmel az eluens szintjét, és töltse újra, mielőtt az a homokréteg alá süllyed.
22) Rendszeresen tartsa szemmel az eluens szintjét, és töltse újra, mielőtt az a homokréteg alá süllyed.
a) Elúció, b) Etil-acetát hozzáadása az oldószer polaritásának növelésére, c) Az oldószer szintje a homokréteghez közelít, d) Újratöltés
Az oldószer polaritásának lehetséges növelése
23) Egyetlen eluens használható az egész oszlopon, különösen, ha az elválasztandó komponensek hasonló Rf-értékkel rendelkeznek. Ha azonban a komponensek Rf-értékei nagyon eltérőek, az oldószer polaritását növelni lehet, miután az egyik komponens eluálódott az oszlopról (11. ábra a).
Az oldószer polaritásának növelésével a komponensek "gyorsabban" fognak eljutni. A gyorsabb elúció több okból is kívánatos. Először is, ha egy komponens már kilépett az oszlopból, az oszlop már elvégezte a feladatát az elválasztással, így a folyamat felgyorsítása nem befolyásolja az összegyűjtött frakciók tisztaságát. Másodszor, minél hosszabb ideig tart az oszlop futtatása, annál szélesebbek lesznek a komponenssávok (a diffúzió miatt), és egy széles sávú anyag összegyűjtése sok oldószert használ (és pazarol).
Az oldószer polaritásának növelésével a komponensek "gyorsabban" fognak eljutni. A gyorsabb elúció több okból is kívánatos. Először is, ha egy komponens már kilépett az oszlopból, az oszlop már elvégezte a feladatát az elválasztással, így a folyamat felgyorsítása nem befolyásolja az összegyűjtött frakciók tisztaságát. Másodszor, minél hosszabb ideig tart az oszlop futtatása, annál szélesebbek lesznek a komponenssávok (a diffúzió miatt), és egy széles sávú anyag összegyűjtése sok oldószert használ (és pazarol).
ábra
Tartalmazza az eluotróp sorozatok részleges listáját, a normálfázisú kromatográfiában használatos gyakori oldószerek "oldóerejük" szerint rangsorolt listáját. A polárisabb oldószer okozza a legdrámaibb növekedést az Rf
24 ) Az oldószer polaritásának növeléséhez a poláros oldószert közvetlenül az oszlop tartályán lévő eluensbe lehet csepegtetni (11. ábra b). Ha például hexán:etil-acetát keveréket használunk, tiszta etil-acetát hozzáadása az éppen a tartályban lévő eluenshez növeli annak polaritását. Ha az eluens szintje alacsony, olyan oldatot lehet készíteni, amely nagyobb százalékban tartalmazza a polárisabb komponenst. Például, ha az oszlop először 4:1 arányú hexán:etil-acetát keveréket használt, az 1:1 arányú keverék használata polárisabb oldószert jelentene.
25) Az oszlopot az előzőekhez hasonlóan a polárisabb oldószerrel eluálja, és ne felejtse el mindig figyelni az eluens szintjét, és töltse újra (11. ábra d), mielőtt az a homokréteg alá süllyedne.
26 ) Az oldószer polaritásának növelése érdekében a poláros oldószert közvetlenül az oszlop tartályán lévő eluensbe csepegtethetjük (11. ábra b). Ha például hexán:etil-acetát keveréket használunk, tiszta etil-acetát hozzáadása az éppen a tartályban lévő eluenshez növeli annak polaritását. Ha az eluens szintje alacsony, olyan oldatot lehet készíteni, amely nagyobb százalékban tartalmazza a polárisabb komponenst. Például, ha az oszlop először 4:1 arányú hexán:etil-acetát keveréket használt, az 1:1 arányú keverék használata polárisabb oldószert jelentene.
27) Az oszlopot az előzőekhez hasonlóan a polárisabb oldószerrel eluálja, és ne feledje mindig figyelni az eluens szintjét, és töltse újra (11. ábra d), mielőtt az a homokréteg alá süllyedne.
25) Az oszlopot az előzőekhez hasonlóan a polárisabb oldószerrel eluálja, és ne felejtse el mindig figyelni az eluens szintjét, és töltse újra (11. ábra d), mielőtt az a homokréteg alá süllyedne.
26 ) Az oldószer polaritásának növelése érdekében a poláros oldószert közvetlenül az oszlop tartályán lévő eluensbe csepegtethetjük (11. ábra b). Ha például hexán:etil-acetát keveréket használunk, tiszta etil-acetát hozzáadása az éppen a tartályban lévő eluenshez növeli annak polaritását. Ha az eluens szintje alacsony, olyan oldatot lehet készíteni, amely nagyobb százalékban tartalmazza a polárisabb komponenst. Például, ha az oszlop először 4:1 arányú hexán:etil-acetát keveréket használt, az 1:1 arányú keverék használata polárisabb oldószert jelentene.
27) Az oszlopot az előzőekhez hasonlóan a polárisabb oldószerrel eluálja, és ne feledje mindig figyelni az eluens szintjét, és töltse újra (11. ábra d), mielőtt az a homokréteg alá süllyedne.
ábra
a) Eredeti TLC lemez, b) Az oszlop által összegyűjtött frakciók, c) A frakciók TLC lemezre történő felszórása, d) Az egyes frakciók mintáinak vizualizált TLC lemeze.
a) Eredeti TLC lemez, b) Az oszlop által összegyűjtött frakciók, c) A frakciók TLC lemezre történő felszórása, d) Az egyes frakciók mintáinak vizualizált TLC lemeze.
A kívánt komponens megtalálása és koncentrálása
28 ) A kívánt komponens megtalálásához a kémcsőfrakciókban hasznos megérteni az Rf és az elúciós sorrend közötti összefüggést az oszlopkromatográfiában.Az oszlopkromatográfiában a minta az oszlopot vezetve kerül lerakásra és lefelé eluálódik, míg a vékonyréteg-kromatográfiában a minta a lemez aljára kerül és felfelé eluálódik. Ezért az oszlopot úgy lehet elképzelni, mint egy fejjel lefelé fordított TLC-lemezt. A magasabb Rf értékkel rendelkező vegyület "gyorsabban fut", vagyis a TLC lemezen magasabban fog végezni, és az oszlopon először lesz összegyűjtve. Az ebben a szakaszban bemutatott oszlopban az alacsonyabb Rf-jű komponens (narancssárga a TLC-lemezen a 13. a) ábrán) az a komponens, amelyet az oszlopról másodikként gyűjtenek be.
29) Először határozza meg, hogy mely kémcsövek tartalmaznak oldott vegyületet.
29) Először határozza meg, hogy mely kémcsövek tartalmaznak oldott vegyületet.
a) Helyezzünk minden frakcióból egy mintát a TLC-lemezre, amelyet a frakciószámokkal jelöltünk meg, amelyek megfelelnek a begyűjtés sorrendjének (13. ábra c). A legjobb lehet, ha minden mintát 2-3 alkalommal egymás fölé foltozunk, ha a frakciók hígak.
b) Ha sok frakciót gyűjtöttünk, ami miatt nem biztos, hogy minden frakciót meg tudunk mintavételezni, a színtelen, esetleg vegyületet tartalmazó frakciók azonosításának egyik módszere, hogy a kémcsöveket vezető maradék nyomát keressük. A párolgás után néha szilárd maradék (13. ábra) vagy olajos cseppek maradnak a kémcső tetején, ami nyilvánvalóvá teszi, hogy ezek a frakciók nem csak oldószert tartalmaznak. Vegyen mintát a látható maradékot tartalmazó csövek közelében lévő összes frakcióból.
.
c) Vizualizáljuk a foltos TLC-lemezt UV-fény és/vagy festék segítségével, hogy meghatározzuk, mely frakciók tartalmaznak vegyületet (13. ábra d).
c) Vizualizáljuk a foltos TLC-lemezt UV-fény és/vagy festék segítségével, hogy meghatározzuk, mely frakciók tartalmaznak vegyületet (13. ábra d).
a) A lehetséges vegyületet tartalmazó frakciók eluált TLC lemezei, b) Frakciók egyesítése, c) Frakciós cső öblítése
28) Futtasson TLC-t az összes vegyületet tartalmazó frakcióból, 2,5 cm széles TLC-lemezenként legfeljebb öt mintát foltozva. Ha rendelkezésre állnak, szélesebb TLC-lemezek is használhatók erre a célra.
29) Azonosítsuk a kívánt Rf értékű vegyületet az eredeti nyers TLC lemezzel való összehasonlítással. Válassza ki, hogy azokat a frakciókat tartja meg, amelyekben a kívánt vegyület tiszta formában van jelen, amint azt az eluált TLC-lemez bizonyítja. Például, ha a 15. a. ábrán a magasabb Rf értékkel rendelkező vegyületet szeretnénk, akkor a 6-10. frakciókat kell megtartani.
30) Egyesítsük a tiszta frakciókat egy megfelelő méretű (legfeljebb félig teli, 15. b ábra) kerekfenekű lombikba. Öblítsünk át minden kémcsövet egy kis mennyiségű eluenssel (vagy más oldószerrel, ha az oldhatóság problémát jelent), és adjuk az öblítést a kerekfenekű lombikba (15. c ábra).
31) Pároljuk el az oldószert a rotációs elpárologtatón, hogy a tisztított vegyület a lombikban maradjon.
29) Azonosítsuk a kívánt Rf értékű vegyületet az eredeti nyers TLC lemezzel való összehasonlítással. Válassza ki, hogy azokat a frakciókat tartja meg, amelyekben a kívánt vegyület tiszta formában van jelen, amint azt az eluált TLC-lemez bizonyítja. Például, ha a 15. a. ábrán a magasabb Rf értékkel rendelkező vegyületet szeretnénk, akkor a 6-10. frakciókat kell megtartani.
30) Egyesítsük a tiszta frakciókat egy megfelelő méretű (legfeljebb félig teli, 15. b ábra) kerekfenekű lombikba. Öblítsünk át minden kémcsövet egy kis mennyiségű eluenssel (vagy más oldószerrel, ha az oldhatóság problémát jelent), és adjuk az öblítést a kerekfenekű lombikba (15. c ábra).
31) Pároljuk el az oldószert a rotációs elpárologtatón, hogy a tisztított vegyület a lombikban maradjon.
ábra
a) Az oszlop szárítása légnyomással, b) Az oszlop fejjel lefelé történő szárítása, c) A hulladék szilícium-dioxid összegyűjtése.
a) Az oszlop szárítása légnyomással, b) Az oszlop fejjel lefelé történő szárítása, c) A hulladék szilícium-dioxid összegyűjtése.
Az oszlop megtisztítása
32) Az oszlop szárításához alkalmazzon légnyomást, hogy az eluens nagy részét az oszlopból egy hulladéktartályba ürítse. Ezután szárítsa tovább az oszlopot az alábbi módszerek valamelyikével.
a) Hagyja bekötve az oszlopon keresztüláramló enyhe légáramot, hogy tovább szárítsa azt, miközben más dolgokat takarít (16. ábra a).
b) Fogja le az oszlopot fejjel lefelé egy nagy hulladékpohár fölé a szagelszívóban, hogy az adszorbens leessen, amikor megszáradt (16. ábra b). Ez sokáig fog tartani (a következő tanítási óráig), de ez egy lehetőség.
33 ) Amikor megszáradt, az adszorbens kiönthető az oszlopból a kipufogóban lévő hulladéktartályba (16. ábra c).
Biztonsági megjegyzés: A por alakú adszorbensek tüdőirritáló hatásúak, és veszélyességüket fokozza, ha az oszlopban maradék vegyületek találhatók, amelyek most utat találhatnak a tüdőbe. A szilícium-dioxid- vagy timföldporok kiöntését mindig a füstgázelszívóban kell végezni.
34) Amikor az adszorbens nagy része összegyűlt a hulladéktartályban, vízzel öblítse ki a maradék szilárd anyagot a mosogatóba, majd az oszlopot acetonnal öblítse ki egy hulladékpohárba. Továbbá tisztítsa meg az oszlopot szappannal és vízzel, és szárítsa meg úgy, hogy a csaprészeket különítse el.
Biztonsági megjegyzés: A por alakú adszorbensek tüdőirritáló hatásúak, és veszélyességüket fokozza, ha az oszlopban maradék vegyületek találhatók, amelyek most utat találhatnak a tüdőbe. A szilícium-dioxid- vagy timföldporok kiöntését mindig a füstgázelszívóban kell végezni.
34) Amikor az adszorbens nagy része összegyűlt a hulladéktartályban, vízzel öblítse ki a maradék szilárd anyagot a mosogatóba, majd az oszlopot acetonnal öblítse ki egy hulladékpohárba. Továbbá tisztítsa meg az oszlopot szappannal és vízzel, és szárítsa meg úgy, hogy a csaprészeket különítse el.
Hibaelhárítás
Légbuborékok jelennek meg az oszlopban
A légbuborék egy üres zseb, ahol nem történik meg az álló-mozgó fázis kiegyenlítődése, ezért a komponensek gyorsabban mozognak a légbuborék körül, mint kellene. Ez egyenlőtlen eluálási sávokhoz vezethet, ami átfedéseket okozhat, ha a keverék elválasztása nehézkes (ha a komponensek Rf-értékei nagyon közel vannak egymáshoz, mint a 17. ábrán).
Ha az oszlopban légbuborékokat lát, és a homok vagy a minta még nem került felhordásra, akkor a csomagolás során alaposan rázza meg az oszlopot, hogy az összes légbuborékot eltávolítsa. Keresse fel oktatóját, ha a buborékok nem mozdulnak, mivel lehet, hogy túl finoman közelíti meg a feladatot. Ha a homokot vagy a mintát már felhordtuk, a legjobb, ha az oszlopot úgy hagyjuk, ahogy van, és reméljük, hogy a légbuborékok nem befolyásolják az elválasztást.
A sávok egyenetlenül eluálódnak
Ha egy keverék összetevői színezettek, nyilvánvaló lehet, ha a sávok ferdén eluálódnak. Ez valószínűleg annak köszönhető, hogy az oszlopot enyhe átlósan szorították be. Ha az oszlopot ferdén rögzítik, a komponensek ferdén fognak eljutni (18. ábra). Ez elválasztási problémákat okozhat, ha az alkatrészek hasonló Rf értékkel rendelkeznek.
Ezt a problémát nem lehet megoldani az oszlop közepén, de ha az alkatrészek nagyon eltérő Rf-értékekkel rendelkeznek, akkor a ferde sávok nem biztos, hogy hatással vannak a szétválasztásra. A jövőben mindenképpen ellenőrizze, hogy az oszlop tökéletesen függőleges legyen oldalirányban és elöl-hátul irányban is.
Last edited by a moderator:
