Introduction
La chromatographie sur colonne est une extension de la chromatographie sur couche mince (CCM). Nous supposons que le lecteur a une certaine expérience de la pratique en laboratoire et qu'il a déjà eu affaire à la chromatographie sur couche mince. Au lieu d'appliquer un échantillon sur une fine couche de silice ou d'alumine, un échantillon est déposé sur un cylindre d'adsorbant et le solvant est appliqué continuellement sous pression jusqu'à ce que les composants s'écoulent complètement du cylindre. Grâce à cette modification, les composants peuvent être non seulement séparés, mais aussi collectés dans différents conteneurs, ce qui permet de purifier les mélanges et de séparer les médicaments des pollutions. La chromatographie sur colonne (également connue sous le nom de "chromatographie flash") est fréquemment utilisée dans le cadre de la recherche, comme en témoigne sa présence fréquente dans les sections procédurales des articles de journaux.
Discussion sur la procédure
Les mêmes principes sous-jacents de la chromatographie sur couche mince (CCM) s'appliquent à la chromatographie sur colonne. En fait, on effectue toujours une CCM avant d'effectuer une chromatographie sur colonne afin d'évaluer la situation et de déterminer le rapport de solvants approprié. Pour obtenir une bonne séparation, l'idéal est que le composant souhaité ait un Rf d'environ 0,35 (voir Rf dans la rubrique CCM) et qu'il soit séparé des autres composants par au moins 0,2 unité Rf. Si les taches à séparer sont très proches (si la différence de Rf est < 0,2), il est préférable que le milieu des taches ait un Rf de 0,35. Un Rf proche de 0,35 est idéal parce qu'il est suffisamment lent pour permettre l'équilibrage de la phase stationnaire-mobile, mais suffisamment rapide pour minimiser l'élargissement de la bande dû à la diffusion.
Il existe quelques variables qui ne s'appliquent pas à la CCM, mais qui affectent la séparation des composants dans la chromatographie sur colonne. Il s'agit notamment du diamètre de la colonne, de la quantité d'adsorbant utilisée et du débit du solvant. La photo 1 montre des recommandations variables en fonction de la taille de l'échantillon et du degré de séparation entre les composants. Dans tous les cas, les colonnes doivent être préparées à une hauteur comprise entre 12,5 et 15 cm.
Il existe quelques variables qui ne s'appliquent pas à la CCM, mais qui affectent la séparation des composants dans la chromatographie sur colonne. Il s'agit notamment du diamètre de la colonne, de la quantité d'adsorbant utilisée et du débit du solvant. La photo 1 montre des recommandations variables en fonction de la taille de l'échantillon et du degré de séparation entre les composants. Dans tous les cas, les colonnes doivent être préparées à une hauteur comprise entre 12,5 et 15 cm.
Par exemple, une colonne de 2,5 cm devrait pouvoir purifier environ 400 mg de matière si la séparation est bonne (ΔRf > 0,2, troisième colonne de la photo 1), ou environ 160 mg si la séparation est difficile (ΔRf > 0,1). La colonne doit pouvoir être préparée et éluée avec environ 200 ml de solvant, et les fractions peuvent être collectées avec environ 10 ml de solution chacune.
Il existe de nombreuses variantes sur la manière de faire fonctionner physiquement une colonne. L'une des grandes différences entre les méthodes est la façon dont la colonne est préparée. Dans la méthode du "garnissage à sec", de la silice ou de l'alumine sèche est ajoutée directement à une colonne, et le solvant est autorisé à s'écouler par portions, puis sous pression. Dans la méthode "wet packing", la colonne est d'abord remplie de solvant, puis la silice ou l'alumine sèche est légèrement secouée, avant d'être emballée sous pression. Dans la méthode "slurry", le solvant est ajouté à la silice ou à l'alumine dans un erlenmeyer, versé sur la colonne sous forme de boue, puis tassé sous pression (la pression peut être produite à l'aide d'une seringue).
Il est important de savoir que la chaleur est libérée lorsque le solvant est ajouté à la silice ou à l'alumine (ils ont une chaleur de solvatation exothermique). La méthode du slurry est présentée dans cette section, la raison principale étant qu'elle permet à cette étape exothermique de se dérouler dans un erlenmeyer plutôt que sur la colonne. Si de la chaleur est libérée pendant le remplissage de la colonne, elle peut générer des bulles provenant de l'ébullition du solvant. Celles-ci peuvent interférer avec la séparation de la colonne si elles ne sont pas éliminées de manière adéquate, et peuvent fissurer le matériau adsorbant dans la colonne.
Il existe de nombreuses variantes sur la manière de faire fonctionner physiquement une colonne. L'une des grandes différences entre les méthodes est la façon dont la colonne est préparée. Dans la méthode du "garnissage à sec", de la silice ou de l'alumine sèche est ajoutée directement à une colonne, et le solvant est autorisé à s'écouler par portions, puis sous pression. Dans la méthode "wet packing", la colonne est d'abord remplie de solvant, puis la silice ou l'alumine sèche est légèrement secouée, avant d'être emballée sous pression. Dans la méthode "slurry", le solvant est ajouté à la silice ou à l'alumine dans un erlenmeyer, versé sur la colonne sous forme de boue, puis tassé sous pression (la pression peut être produite à l'aide d'une seringue).
Il est important de savoir que la chaleur est libérée lorsque le solvant est ajouté à la silice ou à l'alumine (ils ont une chaleur de solvatation exothermique). La méthode du slurry est présentée dans cette section, la raison principale étant qu'elle permet à cette étape exothermique de se dérouler dans un erlenmeyer plutôt que sur la colonne. Si de la chaleur est libérée pendant le remplissage de la colonne, elle peut générer des bulles provenant de l'ébullition du solvant. Celles-ci peuvent interférer avec la séparation de la colonne si elles ne sont pas éliminées de manière adéquate, et peuvent fissurer le matériau adsorbant dans la colonne.
Procédures étape par étape
a) CCM du mélange ferrocène/acétylferrocène, b ) Chromatographie sur colonne
La colonne illustrée dans cette section montre la purification d'un échantillon de 0,20 g contenant un mélange de ferrocène et d'acétylferrocène (la CCM brute se trouve dans la Fig.2 a). Des fractions d'environ 8 ml ont été recueillies dans de petits tubes à essai, et environ 400 ml d'éluant ont été utilisés.
Fig.
a) Plaque CCM du mélange ferrocène/acétylferrocène brut avant élution, b) Après élution, c ) Colonne avec fritte, d) Colonne avec coton coincé dans le fond, e) Colonne sans le coin de coton (devrait être inséré avant l'utilisation)
a) Plaque CCM du mélange ferrocène/acétylferrocène brut avant élution, b) Après élution, c ) Colonne avec fritte, d) Colonne avec coton coincé dans le fond, e) Colonne sans le coin de coton (devrait être inséré avant l'utilisation)
Effectuer un TLC
1) Effectuer une CCM sur l'échantillon à purifier (Fig.3 a et b) pour déterminer le solvant approprié pour la chromatographie. Le composant souhaité doit avoir un Rf d'environ 0,35 et doit idéalement être séparé de toutes les autres taches par au moins 0,2 unités Rf.
2) Préparer un lot d'éluant qui donne la valeur Rf appropriée. La quantité préparée dépend de la quantité d'échantillon, de la taille de la colonne et de la possibilité de modifier la composition du solvant à mi-parcours. (Voir la figure 1 pour les lignes directrices et la série éluotropique pour les tendances en matière de "puissance du solvant").
2) Préparer un lot d'éluant qui donne la valeur Rf appropriée. La quantité préparée dépend de la quantité d'échantillon, de la taille de la colonne et de la possibilité de modifier la composition du solvant à mi-parcours. (Voir la figure 1 pour les lignes directrices et la série éluotropique pour les tendances en matière de "puissance du solvant").
Préparer la colonne garnie
3) Procurez-vous une colonne appropriée (voir Fig. 1) et assurez-vous qu'il y a quelque chose près du robinet d'arrêt qui permettra au liquide de passer, mais pas au solide. Les colonnes peuvent avoir un disque fritté (également connu sous le nom de "fritte"), Fig.3 c), ou un bouchon de coton ou de laine de verre restant de l'utilisateur précédent (Fig.3 d). S'il n'y a pas de disque ou de bouchon (Fig.3 e), coincez un petit tampon de coton ou de laine de verre dans le fond de la colonne à l'aide d'une longue tige.
Fig.
a ) Versement de la silice à une hauteur de 12,5-15 cm dans la hotte, b) Versement de la silice dans un erlenmeyer, c et d) Fabrication d'une suspension.
a ) Versement de la silice à une hauteur de 12,5-15 cm dans la hotte, b) Versement de la silice dans un erlenmeyer, c et d) Fabrication d'une suspension.
Note de sécurité : la silice et l'alumine en poudre sont des irritants pulmonaires et doivent toujours être manipulés avec précaution sous une hotte. La poussière répandue doit être éliminée en l'essuyant avec une serviette en papier mouillée (si elle est mouillée, les particules fines sont moins dispersives).
5) Sous la hotte, verser l'adsorbant mesuré dans la colonne dans un erlenmeyer (Fig.4 b), puis ajouter un peu d'éluant (Fig.4 c). Faire une boue fluide en agitant avec un agitateur en verre (Fig.4 d) jusqu'à ce que l'adsorbant soit complètement mouillé, que les bulles de gaz soient libérées et que la consistance soit un peu épaisse, mais coulante.
Fig.
a ) Versement de la suspension dans la colonne, b) Rinçage du flacon, c ) Adsorbant adhérant aux parois de la colonne, d) Rinçage de l'adsorbant adhérant.
a ) Versement de la suspension dans la colonne, b) Rinçage du flacon, c ) Adsorbant adhérant aux parois de la colonne, d) Rinçage de l'adsorbant adhérant.
6) Placer un bécher ou un erlenmeyer sous la colonne clampée et ouvrir le robinet d'arrêt. D'un geste rapide, agiter et verser la suspension de silice ou d'alumine dans la colonne à l'aide d'un entonnoir à large ouverture (Fig. 5 a). Utiliser immédiatement plus d'éluant pour rincer la suspension résiduelle hors de l'erlenmeyer (Fig. 5 b) et sur la colonne.
7) Rincer immédiatement toute silice ou alumine sur les côtés du réservoir de la colonne en utilisant de l'éluant et en faisant tourner une pipette Pasteur (Fig.5 c et d). Si on le laisse sécher, l'adsorbant s'accrochera au verre et ne pourra pas être facilement rincé.
7) Rincer immédiatement toute silice ou alumine sur les côtés du réservoir de la colonne en utilisant de l'éluant et en faisant tourner une pipette Pasteur (Fig.5 c et d). Si on le laisse sécher, l'adsorbant s'accrochera au verre et ne pourra pas être facilement rincé.
Fig.
a ) Bousculer la colonne pour éliminer les bulles d'air, b ) Appliquer une pression d'air, c ) Ajouter du sable, d) Rincer le sable sur les côtés.
a ) Bousculer la colonne pour éliminer les bulles d'air, b ) Appliquer une pression d'air, c ) Ajouter du sable, d) Rincer le sable sur les côtés.
8) Bousculer fermement la colonne à l'aide d'un anneau de liège ou de vos articulations (Fig.6 a) pour déloger les bulles d'air présentes dans la colonne (qui pourraient entraîner une mauvaise séparation ou une fissuration de l'adsorbant dans la colonne), et pour favoriser un dépôt uniforme de l'adsorbant.
9) Appliquer une légère pression d'air sur le haut de la colonne (Fig.6 b) pour la comprimer, en s'arrêtant lorsque le niveau de l'éluant est à 1 cm du haut de la colonne. Si un adaptateur en T est utilisé avec la conduite d'air comme dans la figure 6 b, un contrôle fin du débit d'air peut être effectué en ajustant la pince sur le tube en caoutchouc. Pendant toute la durée du processus d'élution, la colonne blanche d'adsorbant doit rester humide, le niveau de l'éluant se trouvant au-dessus du sommet de la silice ou de l'alumine. Briser doucement le joint pour arrêter l'application de la pression et fermer le robinet d'arrêt pour empêcher le liquide de s'écouler davantage.
10) Ajouter une fine couche de sable (Fig.6 c), d'une hauteur d'environ 0,5 cm. Rincer les parois de la colonne avec de l'éluant en effectuant un mouvement de tourbillon pour déloger le sable des parois du verre (Fig.6 d). Ouvrir le robinet d'arrêt et laisser le liquide s'écouler jusqu'à ce qu'il soit juste au-dessus de la couche de sable. Appliquer une pression d'air si l'écoulement est trop lent.
9) Appliquer une légère pression d'air sur le haut de la colonne (Fig.6 b) pour la comprimer, en s'arrêtant lorsque le niveau de l'éluant est à 1 cm du haut de la colonne. Si un adaptateur en T est utilisé avec la conduite d'air comme dans la figure 6 b, un contrôle fin du débit d'air peut être effectué en ajustant la pince sur le tube en caoutchouc. Pendant toute la durée du processus d'élution, la colonne blanche d'adsorbant doit rester humide, le niveau de l'éluant se trouvant au-dessus du sommet de la silice ou de l'alumine. Briser doucement le joint pour arrêter l'application de la pression et fermer le robinet d'arrêt pour empêcher le liquide de s'écouler davantage.
10) Ajouter une fine couche de sable (Fig.6 c), d'une hauteur d'environ 0,5 cm. Rincer les parois de la colonne avec de l'éluant en effectuant un mouvement de tourbillon pour déloger le sable des parois du verre (Fig.6 d). Ouvrir le robinet d'arrêt et laisser le liquide s'écouler jusqu'à ce qu'il soit juste au-dessus de la couche de sable. Appliquer une pression d'air si l'écoulement est trop lent.
Ajouter l'échantillon
Une fois l'échantillon déposé dans la colonne, une course contre la montre s'engage, car la diffusion commence à élargir le matériau. L'échantillon ne doit pas être appliqué tant que vous n'êtes pas prêt à compléter la colonne immédiatement et dans son intégralité. Ce processus peut prendre entre 15 et 90 minutes ! Si vous utilisez des tubes à essai pour collecter les fractions, les tubes à essai doivent être placés dans un support avant d'ajouter l'échantillon, et la hauteur de la colonne doit être réglée de manière à ce que le support de tubes à essai puisse être glissé en dessous.
a ) Dissolution d'un solide avec une petite quantité de dichlorométhane, b ) Application de l'échantillon, c) Rinçage de l'échantillon dans son flacon, d) Application d'une pression pour pousser l'échantillon sur la colonne juste après la couche de sable.
11) Si l'échantillon brut est un liquide, l'utiliser directement (passer à l'étape 13).
12) Si l'échantillon brut est un solide, faites l'une des choses suivantes.
12) Si l'échantillon brut est un solide, faites l'une des choses suivantes.
a) Situation idéale : dissoudre le solide dans la quantité minimale d'éluant (quelques ml au maximum).
b) Si le solide n'est pas particulièrement soluble ou ne se dissout pas dans quelques ml d'éluant, le dissoudre dans la quantité minimale de dichlorométhane (quelques ml au maximum, Fig.7 a).
c) Si le solide est insoluble dans l'éluant, une procédure alternative est également possible. Dissoudre le solide dans un ballon à fond rond en utilisant quelques ml d'un solvant à faible point d'ébullition (par exemple dichlorométhane ou acétone). Ajouter au ballon environ 1 g de silice ou d'alumine, puis éliminer le solvant sur l'évaporateur rotatif pour laisser un solide contenant l'échantillon déposé sur l'adsorbant. Avec un pouce d'éluant reposant sur la colonne garnie (ne pas ajouter la couche de sable si cette méthode est utilisée), verser l'échantillon adsorbé par la silice sur la colonne à l'aide d'un entonnoir à large ouverture. Si de la poussière reste accrochée au verre, le rincer avec plus d'éluant (passer à l'étape 15).
13) Ajouter délicatement l'échantillon à la colonne à l'aide d'une pipette, en faisant couler le liquide ou la solution directement sur le sable avec la pointe de la pipette aussi près que possible, sans descendre sur les côtés (Fig.7 b). Veillez à ne pas injecter le liquide avec force, ce qui provoquerait des indentations dans le sable ou la colonne de silice/alumine.
14) Rincer le récipient d'échantillon avec un peu de solvant (ou de dichlorométhane si utilisé, Fig.7 c) et ajouter le liquide de rinçage à la colonne en utilisant la même pipette (pour rincer également la pipette).
15) Ouvrir le robinet d'arrêt et laisser le liquide s'écouler jusqu'à ce que l'échantillon soit juste au-delà de la couche de sable (Fig.7 d) et dans la zone blanche de la colonne (appliquer une pression d'air si cela prend plus de 20 secondes).
16) Rincer doucement les côtés de la colonne par un mouvement tourbillonnant en utilisant 1 à 2 pipettes pleines d'éluant pour rincer toute éclaboussure d'échantillon. Une fois encore, laissez le liquide s'écouler (ou appliquez une pression d'air) jusqu'à ce que l'échantillon soit poussé dans l'adsorbant blanc.
Répétez l'étape de rinçage jusqu'à ce que vous soyez sûr que tout l'échantillon est déposé sur l'adsorbant. Si une partie de l'échantillon se trouve encore dans la couche de sable, elle peut se dissoudre dans l'éluant lorsqu'on ajoute du solvant, ce qui entraîne une perte de rendement. Si le composé est coloré, le rinçage doit être complètement clair.
14) Rincer le récipient d'échantillon avec un peu de solvant (ou de dichlorométhane si utilisé, Fig.7 c) et ajouter le liquide de rinçage à la colonne en utilisant la même pipette (pour rincer également la pipette).
15) Ouvrir le robinet d'arrêt et laisser le liquide s'écouler jusqu'à ce que l'échantillon soit juste au-delà de la couche de sable (Fig.7 d) et dans la zone blanche de la colonne (appliquer une pression d'air si cela prend plus de 20 secondes).
16) Rincer doucement les côtés de la colonne par un mouvement tourbillonnant en utilisant 1 à 2 pipettes pleines d'éluant pour rincer toute éclaboussure d'échantillon. Une fois encore, laissez le liquide s'écouler (ou appliquez une pression d'air) jusqu'à ce que l'échantillon soit poussé dans l'adsorbant blanc.
Répétez l'étape de rinçage jusqu'à ce que vous soyez sûr que tout l'échantillon est déposé sur l'adsorbant. Si une partie de l'échantillon se trouve encore dans la couche de sable, elle peut se dissoudre dans l'éluant lorsqu'on ajoute du solvant, ce qui entraîne une perte de rendement. Si le composé est coloré, le rinçage doit être complètement clair.
a et b) Remplissage du réservoir de solvant, c et d) Elution de la colonne
Remplir d'éluant et éluer la colonne
17) Ajouter délicatement de l'éluant à l'aide d'une pipette (Fig.8 a), en faisant tourbillonner les côtés, puis, lorsque la couche de sable n'est plus perturbée par les ajouts, verser avec précaution de plus grandes quantités (Fig.8 b) de l'éluant préparé pour remplir le réservoir (ou le remplir autant que nécessaire). L'éluant propre recueilli pendant le remplissage de la colonne peut être réutilisé.
18) Utiliser la pression de l'air pour éluer doucement et régulièrement l'échantillon à travers la colonne (Fig.8 c et d). Plus la pression est démarrée et arrêtée, plus la colonne risque de se fissurer. Il est préférable de maintenir une pression douce et régulière pendant toute la durée de l'élution.
Le débit optimal pendant l'élution dépend de la taille de la colonne. Le débit idéal de l'éluant est lorsque le solvant dans la section cylindrique de la colonne au-dessus de l'adsorbant chute de 5 cm par minute. Par conséquent, la vitesse d'écoulement doit être plus lente avec une colonne étroite qu'avec une colonne plus large. La vitesse d'égouttage pour une colonne d'un pouce devrait être telle que les gouttes individuelles puissent être à peine distinguées. Un flux de liquide s'écoulant du robinet d'arrêt avec cette taille de colonne est légèrement trop rapide.
18) Utiliser la pression de l'air pour éluer doucement et régulièrement l'échantillon à travers la colonne (Fig.8 c et d). Plus la pression est démarrée et arrêtée, plus la colonne risque de se fissurer. Il est préférable de maintenir une pression douce et régulière pendant toute la durée de l'élution.
Le débit optimal pendant l'élution dépend de la taille de la colonne. Le débit idéal de l'éluant est lorsque le solvant dans la section cylindrique de la colonne au-dessus de l'adsorbant chute de 5 cm par minute. Par conséquent, la vitesse d'écoulement doit être plus lente avec une colonne étroite qu'avec une colonne plus large. La vitesse d'égouttage pour une colonne d'un pouce devrait être telle que les gouttes individuelles puissent être à peine distinguées. Un flux de liquide s'écoulant du robinet d'arrêt avec cette taille de colonne est légèrement trop rapide.
a-c) Collecte des fractions, d) Fonctionnement d'une colonne
Collectedes fractions
19) Commencer immédiatement à collecter le liquide d'élution dans des tubes à essai sur un support (Fig.9 a). Voir Fig.1 pour les recommandations sur les volumes à collecter dans chaque tube à essai.20) Lorsque le premier tube à essai se remplit, ou si une certaine hauteur de liquide a été collectée selon les recommandations de votre instructeur ou de la Fig.1, déplacez le support pour commencer à collecter dans un autre tube (Fig.9 b et c). Remplissez les tubes et conservez-les dans l'ordre sur le support.
Ces différents tubes sont appelés "fractions". L'objectif d'une colonne est de collecter des fractions suffisamment petites pour que la plupart (ou certaines) d'entre elles contiennent du matériel pur. Si la séparation du mélange est difficile (si le ΔRf des composants est faible), il peut être préférable de collecter de petites fractions (par exemple, des tubes à moitié remplis).
Ces différents tubes sont appelés "fractions". L'objectif d'une colonne est de collecter des fractions suffisamment petites pour que la plupart (ou certaines) d'entre elles contiennent du matériel pur. Si la séparation du mélange est difficile (si le ΔRf des composants est faible), il peut être préférable de collecter de petites fractions (par exemple, des tubes à moitié remplis).
a-c) Matériau de rinçage éclaboussant l'extrémité de la colonne, d) Étudiants faisant fonctionner une colonne
21) Lorsque le liquide s'écoule de la colonne, il éclabousse souvent l'extérieur de l'extrémité de la colonne et, lorsque le solvant s'évapore, vous pouvez voir un anneau de matière sur l'extrémité (vous verrez un anneau de solide si le composant est un solide comme dans la Fig.10 b, ou des gouttelettes huileuses si le composant est un liquide). Si les composants sont colorés, l'extrémité de la colonne doit être rincée (Fig.10 c) lorsqu'il apparaît qu'un composant a été complètement élué et avant que l'autre composant ne s'approche.
22) Surveiller périodiquement le niveau de l'éluant et le remplir avant qu'il ne descende en dessous de la couche de sable.
22) Surveiller périodiquement le niveau de l'éluant et le remplir avant qu'il ne descende en dessous de la couche de sable.
a ) Élution, b) Ajout d'acétate d'éthyle pour augmenter la polarité du solvant, c ) Le niveau de solvant s'approche de la couche de sable, d) Remplissage
Augmenter éventuellement la polarité du solvant
23) Un seul éluant peut être utilisé dans toute la colonne, en particulier si les composants à séparer ont des valeurs Rf similaires. Cependant, si les composants ont des valeurs Rf très différentes, la polarité du solvant peut être augmentée après l'élution d'un composant de la colonne (Fig.11 a).
L'augmentation de la polarité du solvant accélère l'élution des composants, et ce pour plusieurs raisons. Tout d'abord, si un composant est déjà sorti de la colonne, celle-ci a déjà effectué son travail de séparation, de sorte qu'accélérer le processus n'affectera pas la pureté des fractions collectées. Deuxièmement, plus il faut de temps pour faire fonctionner une colonne, plus les bandes de composants seront larges (en raison de la diffusion), et la collecte d'une large bande de matériaux utilisera (et gaspillera) beaucoup de solvant.
L'augmentation de la polarité du solvant accélère l'élution des composants, et ce pour plusieurs raisons. Tout d'abord, si un composant est déjà sorti de la colonne, celle-ci a déjà effectué son travail de séparation, de sorte qu'accélérer le processus n'affectera pas la pureté des fractions collectées. Deuxièmement, plus il faut de temps pour faire fonctionner une colonne, plus les bandes de composants seront larges (en raison de la diffusion), et la collecte d'une large bande de matériaux utilisera (et gaspillera) beaucoup de solvant.
Contient une liste partielle de la série éluotropique, une liste de solvants courants classés en fonction de leur "pouvoir solvant" dans la chromatographie en phase normale. Le solvant le plus polaire entraîne l'augmentation la plus spectaculaire de Rf
24) Pour augmenter la polarité du solvant, le solvant polaire peut être versé directement dans l'éluant sur le réservoir de la colonne (Fig.11 b). Par exemple, si l'on utilise un mélange hexanes/acétate d'éthyle, l'ajout d'acétate d'éthyle pur à l'éluant se trouvant dans le réservoir augmentera sa polarité. Si le niveau de l'éluant est faible, une solution contenant un pourcentage plus élevé du composant le plus polaire peut être préparée. Par exemple, si la colonne a d'abord utilisé un mélange hexanes/acétate d'éthyle 4:1, l'utilisation d'un mélange 1:1 serait un solvant plus polaire.
25) Eluer la colonne avec le solvant plus polaire comme précédemment, et toujours se rappeler de surveiller le niveau de l'éluant, et de le remplir (Fig.11 d) avant qu'il ne descende en dessous de la couche de sable.
26) Pour augmenter la polarité du solvant, le solvant polaire peut être versé directement dans l'éluant sur le réservoir de la colonne (Fig.11 b). Par exemple, si l'on utilise un mélange hexanes/acétate d'éthyle, l'ajout d'acétate d'éthyle pur à l'éluant se trouvant dans le réservoir augmentera sa polarité. Si le niveau de l'éluant est faible, une solution contenant un pourcentage plus élevé du composant le plus polaire peut être préparée. Par exemple, si la colonne a d'abord utilisé un mélange hexanes/acétate d'éthyle 4:1, l'utilisation d'un mélange 1:1 serait un solvant plus polaire.
27) Eluer la colonne avec le solvant plus polaire comme précédemment, et ne pas oublier de surveiller le niveau de l'éluant, et de le remplir (Fig.11 d) avant qu'il ne descende en dessous de la couche de sable.
25) Eluer la colonne avec le solvant plus polaire comme précédemment, et toujours se rappeler de surveiller le niveau de l'éluant, et de le remplir (Fig.11 d) avant qu'il ne descende en dessous de la couche de sable.
26) Pour augmenter la polarité du solvant, le solvant polaire peut être versé directement dans l'éluant sur le réservoir de la colonne (Fig.11 b). Par exemple, si l'on utilise un mélange hexanes/acétate d'éthyle, l'ajout d'acétate d'éthyle pur à l'éluant se trouvant dans le réservoir augmentera sa polarité. Si le niveau de l'éluant est faible, une solution contenant un pourcentage plus élevé du composant le plus polaire peut être préparée. Par exemple, si la colonne a d'abord utilisé un mélange hexanes/acétate d'éthyle 4:1, l'utilisation d'un mélange 1:1 serait un solvant plus polaire.
27) Eluer la colonne avec le solvant plus polaire comme précédemment, et ne pas oublier de surveiller le niveau de l'éluant, et de le remplir (Fig.11 d) avant qu'il ne descende en dessous de la couche de sable.
Fig.
a ) Plaque TLC originale, b) Fractions collectées par la colonne, c ) Fractions déposées sur une plaque TLC, d) Plaque TLC visualisée d'échantillons de chaque fraction.
a ) Plaque TLC originale, b) Fractions collectées par la colonne, c ) Fractions déposées sur une plaque TLC, d) Plaque TLC visualisée d'échantillons de chaque fraction.
Trouver et concentrer le composant souhaité
28) Pour trouver le composant souhaité dans les fractions de l'éprouvette, il est utile de comprendre la relation entre Rf et l'ordre d'élution dans la chromatographie sur colonne.Dans la chromatographie sur colonne, l'échantillon est déposé en tête de la colonne et élué vers le bas, alors que dans la chromatographie sur couche mince, l'échantillon est déposé au fond de la plaque et élué vers le haut. Par conséquent, une colonne peut être considérée comme une plaque de chromatographie en couche mince à l'envers. Un composé ayant un Rf plus élevé s'écoule "plus rapidement", ce qui signifie qu'il se retrouve plus haut sur une plaque CCM et qu'il est recueilli en premier dans une colonne. Dans la colonne illustrée dans cette section, le composant ayant le Rf le plus bas (orange sur la plaque CCM de la Fig.13 a), est le composant collecté en second dans la colonne.
29) Déterminez d'abord quels tubes à essai contiennent le composé dissous.
29) Déterminez d'abord quels tubes à essai contiennent le composé dissous.
a) Placer un échantillon de chaque fraction sur une plaque CCM étiquetée avec des numéros de fraction correspondant à l'ordre dans lequel ils ont été collectés (Fig.13 c). Il peut être préférable de superposer 2 à 3 fois chaque échantillon au cas où les fractions seraient diluées.
b) Si de nombreuses fractions ont été collectées, ce qui vous fait hésiter à prélever un échantillon de chaque fraction, une méthode pour identifier les fractions incolores qui peuvent contenir un composé consiste à rechercher un soupçon de résidu dans les tubes à essai. Après l'évaporation, un résidu solide (Fig.13) ou des gouttelettes huileuses sont parfois laissés sur le dessus du tube à essai, ce qui indique clairement que ces fractions contiennent plus qu'un simple solvant. Prélevez toutes les fractions à proximité des tubes contenant un résidu visible.
c) Visualiser la plaque TLC tachetée à l'aide d'une lumière UV et/ou d'un colorant pour déterminer quelles fractions contiennent le composé (Fig.13 d).
Fig.
a ) Plaques TLC éluées des fractions contenant un composé possible, b ) Combinaison des fractions, c) Rinçage d'un tube de fraction
a ) Plaques TLC éluées des fractions contenant un composé possible, b ) Combinaison des fractions, c) Rinçage d'un tube de fraction
28) Effectuer une CCM de toutes les fractions contenant un composé, en déposant jusqu'à cinq échantillons par plaque CCM de 2,5 cm de large. Des plaques TLC plus larges peuvent être utilisées à cette fin si elles sont disponibles.
29) Identifier le composé ayant le Rf souhaité en le comparant à la plaque CCM brute d'origine. Choisir de conserver les fractions qui contiennent le composé souhaité sous forme pure, comme le montre la plaque CCM éluée. Par exemple, si le composé ayant le Rf le plus élevé est recherché dans la figure 15 a, les fractions 6 à 10 doivent être conservées.
30) Combiner les fractions pures dans une fiole à fond rond de taille appropriée (pas plus de la moitié, Fig.15 b). Rincer chaque tube à essai avec une petite quantité d'éluant (ou d'un autre solvant si la solubilité est un problème), et ajouter le liquide de rinçage au ballon à fond rond (Fig.15 c).
31) Evaporer le solvant sur l'évaporateur rotatif pour laisser le composé purifié dans le flacon.
29) Identifier le composé ayant le Rf souhaité en le comparant à la plaque CCM brute d'origine. Choisir de conserver les fractions qui contiennent le composé souhaité sous forme pure, comme le montre la plaque CCM éluée. Par exemple, si le composé ayant le Rf le plus élevé est recherché dans la figure 15 a, les fractions 6 à 10 doivent être conservées.
30) Combiner les fractions pures dans une fiole à fond rond de taille appropriée (pas plus de la moitié, Fig.15 b). Rincer chaque tube à essai avec une petite quantité d'éluant (ou d'un autre solvant si la solubilité est un problème), et ajouter le liquide de rinçage au ballon à fond rond (Fig.15 c).
31) Evaporer le solvant sur l'évaporateur rotatif pour laisser le composé purifié dans le flacon.
Fig.
a ) Utilisation de la pression de l'air pour sécher la colonne, b ) Séchage de la colonne à l'envers, c ) Récupération de la silice usagée.
a ) Utilisation de la pression de l'air pour sécher la colonne, b ) Séchage de la colonne à l'envers, c ) Récupération de la silice usagée.
Nettoyage de la colonne
32) Pour sécher la colonne, appliquer une pression d'air pour drainer la majorité de l'éluant de la colonne dans un conteneur à déchets. Sécher ensuite la colonne en utilisant l'une des méthodes suivantes.
a) Laisser un léger courant d'air circuler à travers la colonne pour la sécher pendant que vous nettoyez d'autres choses (Fig.16 a).
b) Fixer la colonne à l'envers au-dessus d'un grand bécher à déchets dans la hotte, de manière à ce que l'adsorbant tombe lorsqu'il aura séché (Fig.16 b). Cela prendra beaucoup de temps (jusqu'à la prochaine période de cours), mais c'est une option.
33) Une fois sec, l'adsorbant peut être versé hors de la colonne dans un conteneur à déchets dans la hotte (Fig.16 c).
Note de sécurité : Les adsorbants en poudre sont un irritant pulmonaire, et leur danger est exacerbé si la colonne contient des composés résiduels qui peuvent maintenant pénétrer dans vos poumons. La coulée des poudres de silice ou d'alumine doit toujours être effectuée sous une hotte.
34) Lorsque la majeure partie de l'adsorbant a été recueillie dans un conteneur à déchets, utilisez de l'eau pour rincer tout solide résiduel dans l'évier, puis rincez la colonne avec de l'acétone dans un bécher à déchets. Nettoyez ensuite la colonne avec de l'eau et du savon et séchez-la en séparant les pièces du robinet d'arrêt.
Note de sécurité : Les adsorbants en poudre sont un irritant pulmonaire, et leur danger est exacerbé si la colonne contient des composés résiduels qui peuvent maintenant pénétrer dans vos poumons. La coulée des poudres de silice ou d'alumine doit toujours être effectuée sous une hotte.
34) Lorsque la majeure partie de l'adsorbant a été recueillie dans un conteneur à déchets, utilisez de l'eau pour rincer tout solide résiduel dans l'évier, puis rincez la colonne avec de l'acétone dans un bécher à déchets. Nettoyez ensuite la colonne avec de l'eau et du savon et séchez-la en séparant les pièces du robinet d'arrêt.
Résolution des problèmes
Des bulles d'air sont visibles dans la colonne
Une bulle d'air est une poche vide où l'équilibre entre la phase stationnaire et la phase mobile ne se produit pas, de sorte que les composants se déplacent plus rapidement qu'ils ne le devraient autour d'une bulle d'air. Cela peut conduire à des bandes d'élution inégales, ce qui peut entraîner un chevauchement si la séparation du mélange est difficile (si les composants ont des valeurs Rf très proches, comme dans la figure 17).
Si des bulles d'air sont visibles dans la colonne et que le sable ou l'échantillon n'a pas encore été appliqué, bousculez bien la colonne pendant le remplissage pour éliminer toutes les bulles d'air. Consultez votre instructeur si les bulles ne bougent pas, car vous abordez peut-être la tâche avec trop de délicatesse. Si le sable ou l'échantillon a déjà été appliqué, il est préférable de laisser la colonne telle quelle et d'espérer que les bulles d'air n'affectent pas la séparation.
Les bandes s'éluent de manière inégale
Si les composants d'un mélange sont colorés, il peut être évident que les bandes s'éluent de travers. Cela est probablement dû au fait que la colonne est serrée légèrement en diagonale. Si la colonne est serrée en biais, les composants se déplacent en biais (Fig. 18). Cela peut entraîner des problèmes de séparation si les composants ont un Rf similaire.
Il n'y a aucun moyen de résoudre ce problème au milieu d'une colonne, mais si les composants ont des valeurs Rf très différentes, les bandes inclinées peuvent n'avoir aucun effet sur la séparation. À l'avenir, veillez à vérifier que la colonne est parfaitement verticale, tant dans le sens latéral que dans le sens avant-arrière.
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