Sissejuhatus
Kolonnkromatograafia on õhukese kihi kromatograafia (TLC) laiendus. Eeldatakse, et lugejal on mõningane laboratoorse praktika kogemus ja ta on tegelenud õhukese kihi kromatograafiaga. Selle asemel, et kanda proovi õhukesele ränidioksiidi või alumiiniumoksiidi kihile, kantakse proov adsorbendi silindrile ja lahustit rakendatakse pidevalt rõhu all, kuni komponendid täielikult silindrist välja voolavad. Selle modifikatsiooni abil saab komponente mitte ainult eraldada, vaid ka koguda erinevatesse mahutitesse, mis võimaldab puhastada segusid ja eraldada ravimid koos saasteainetega. Kolonnkromatograafiat (tuntud ka kui "kiirkromatograafia") kasutatakse sageli teadusuuringutes, nagu näitab selle sagedane esinemine ajakirjade artiklite menetlusosades.
Menetluslik arutelu
Kolonnkromatograafia puhul kehtivad samad põhimõtted, mis õhukese kihi kromatograafia (TLC) puhul. Tegelikult tehakse enne kolonni teostamist alati TLC, et hinnata olukorda ja määrata kindlaks sobiv lahustite suhe. Hea eraldumise saavutamiseks on ideaalne, kui soovitud komponendi Rf on umbes 0,35 (loe Rf kohta TLC-teemast) ja see on teistest komponentidest eraldatud vähemalt 0,2 Rf-ühiku võrra. Kui eraldatavad laigud on väga lähedal (kui Rf erinevus on < 0,2), on parim, kui laikude keskel on Rf 0,35. Rf 0,35 lähedal on ideaalne, sest see on piisavalt aeglane, et statsionaarse ja liikuva faasi tasakaalustamine saaks toimuda, kuid piisavalt kiire, et minimeerida difusioonist tulenevat ribade laienemist.
On mõned muutujad, mis ei kehti TLC puhul, kuid mis mõjutavad komponentide eraldamist kolonnikromatograafias. Nende hulka kuuluvad kolonni läbimõõt, kasutatava adsorbendi kogus ja lahusti voolukiirus. Pilt. 1 on näidatud muutujate soovitused, mis põhinevad proovi suurusel ja komponentide eraldusastmel. Kõigi stsenaariumide puhul tuleb kolonnid ette valmistada vahemikus 12,5-15 cm.
On mõned muutujad, mis ei kehti TLC puhul, kuid mis mõjutavad komponentide eraldamist kolonnikromatograafias. Nende hulka kuuluvad kolonni läbimõõt, kasutatava adsorbendi kogus ja lahusti voolukiirus. Pilt. 1 on näidatud muutujate soovitused, mis põhinevad proovi suurusel ja komponentide eraldusastmel. Kõigi stsenaariumide puhul tuleb kolonnid ette valmistada vahemikus 12,5-15 cm.
Näiteks peaks 2,5 cm kolonniga olema võimalik puhastada umbes 400 mg materjali, kui eraldamine on hea (ΔRf > 0,2, kolmas kolonn joonisel 1), või umbes 160 mg, kui eraldamine on raske (ΔRf > 0,1). Kolonni peaks olema võimalik valmistada ja elueerida umbes 200 ml lahustit kasutades ning fraktsioonid saab koguda umbes 10 ml lahusega.
On mitmeid variante, kuidas kolonni füüsiliselt käivitada. Üks suur erinevus meetodites on see, kuidas kolonni valmistatakse. "Kuiva pakkimise" meetodil lisatakse kuiva ränidioksiidi või alumiiniumoksiidi otse kolonni ja lahustit lastakse läbi tilkuda portsjonite kaupa, seejärel rõhu all. "Märg täitmine" meetodil täidetakse kolonn kõigepealt lahustiga, seejärel raputatakse kuiva ränidioksiidi või alumiiniumoksiidi kergelt sisse ja seejärel täidetakse kolonn rõhu all. "Sula" meetodil lisatakse lahusti ränidioksiidile või alumiiniumoksiidile Erlenmeyeri kolvis, valatakse kolonnile sula materjalina, seejärel täidetakse kolonn rõhu all (rõhku võib toota süstlaga).
Oluline on teada, et lahusti lisamisel ränidioksiidile või alumiiniumoksiidile vabaneb soojus (neil on eksotermiline lahustumissoojus). Käesolevas jaotises on esitatud läga meetod, mille peamine põhjus on see, et see võimaldab seda eksotermilist etappi kolonni asemel Erlenmeyeri kolvis toimuda. Kui kolonni pakkimise ajal vabaneb soojus, võib see tekitada lahusti keemisest tingitud mullid. Need võivad segada kolonni eraldamist, kui neid ei eemaldata piisavalt, ja võivad lõhkuda adsorbendi materjali kolonnis.
On mitmeid variante, kuidas kolonni füüsiliselt käivitada. Üks suur erinevus meetodites on see, kuidas kolonni valmistatakse. "Kuiva pakkimise" meetodil lisatakse kuiva ränidioksiidi või alumiiniumoksiidi otse kolonni ja lahustit lastakse läbi tilkuda portsjonite kaupa, seejärel rõhu all. "Märg täitmine" meetodil täidetakse kolonn kõigepealt lahustiga, seejärel raputatakse kuiva ränidioksiidi või alumiiniumoksiidi kergelt sisse ja seejärel täidetakse kolonn rõhu all. "Sula" meetodil lisatakse lahusti ränidioksiidile või alumiiniumoksiidile Erlenmeyeri kolvis, valatakse kolonnile sula materjalina, seejärel täidetakse kolonn rõhu all (rõhku võib toota süstlaga).
Oluline on teada, et lahusti lisamisel ränidioksiidile või alumiiniumoksiidile vabaneb soojus (neil on eksotermiline lahustumissoojus). Käesolevas jaotises on esitatud läga meetod, mille peamine põhjus on see, et see võimaldab seda eksotermilist etappi kolonni asemel Erlenmeyeri kolvis toimuda. Kui kolonni pakkimise ajal vabaneb soojus, võib see tekitada lahusti keemisest tingitud mullid. Need võivad segada kolonni eraldamist, kui neid ei eemaldata piisavalt, ja võivad lõhkuda adsorbendi materjali kolonnis.
Menetlused samm-sammult
a) ferrotseeni/atsetüülferrotseeni segu TLC, b) kolonnkromatograafia
Selles lõigus kujutatud kolonn näitab 0,20 g proovi puhastamist, mis sisaldab ferrotseeni ja atsetüülferrotseeni segu (toor-TLC on joonisel 2 a). Umbes 8 ml fraktsioone koguti väikestesse katseklaasidesse ja kasutati ligikaudu 400 ml elueenti.
a) TLC-plaat toores ferrotseeni/atsetüülferrotseeni segust enne elueerimist, b) pärast elueerimist, c) kolonn koos fritiga, d) kolonn koos põhja kiilunud puuvillaga, e) kolonn ilma puuvillakiiluta (oleks vaja enne kasutamist sisestada).
Käivitage TLC
1) Tehke puhastatava prooviga TLC (joonis 3 a ja b), et määrata kindlaks kromatograafia jaoks sobiv lahusti. Soovitud komponendi Rf peaks olema umbes 0,35 ja ideaalis peaks see olema kõigist teistest laikudest eraldatud vähemalt 0,2 Rf-ühiku võrra.
2) Valmistage partii elueenti, mis annab sobiva Rf-väärtuse. Valmistatud kogus sõltub proovi kogusest, kolonni suurusest ja sellest, kas lahusti koostist on kavas muuta vahepeal. (Vt joonisel 1 esitatud suuniseid ja eluotroopseeria "lahusti võimsuse" suundumusi).
2) Valmistage partii elueenti, mis annab sobiva Rf-väärtuse. Valmistatud kogus sõltub proovi kogusest, kolonni suurusest ja sellest, kas lahusti koostist on kavas muuta vahepeal. (Vt joonisel 1 esitatud suuniseid ja eluotroopseeria "lahusti võimsuse" suundumusi).
Pakitud kolonni ettevalmistamine
3) Hankige sobiv kolonn (vt joonis 1) ja veenduge, et kolonni lähedal on midagi sellist, mis laseb vedelikku, kuid mitte tahke ainet läbi. Kolonnil võib olla paagutatud ketas (tuntud ka kui "friti"), joonis 3 c), või eelmisest kasutajast järelejäänud puuvillast või klaasvillast tulp (joonis 3 d). Kui ketas või tulp puudub (joonis 3 e), siis kiiluge pika varda abil väike vatt- või klaasvillapuru kolonni põhja.
a) ränidioksiidi valamine 12,5-15 cm kõrgusele suitsutuskapis, b) ränidioksiidi valamine Erlenmeyeri kolbi, c ja d) sette valmistamine
Ohutusalane märkus: Silikapulber ja alumiiniumoksiid on kopsuärritavad ained ja neid tuleb alati ettevaatlikult käsitleda suitsulõõris. Välja valgunud tolm tuleb kõrvaldada, mopides seda märja paberrätikuga (kui see on märg, siis on peened osakesed vähem hajuvad).
5 ) Valage suitsulõõris kolonnis mõõdetud adsorbent Erlenmeyeri kolbi (joonis 4 b), seejärel lisage veidi eluaatorit (joonis 4 c). Tehke lahtine sete, keerutades ja segades klaasist segamispulga abil (joonis 4 d), kuni kogu adsorbent on täielikult märg, gaasimullid vabanevad ja konsistents on mõnevõrra paks, kuid voolav.
a) sette valamine kolonni, b) kolvi loputamine, c) adsorbendi kinnitumine kolonni külgedele, d) külge kleepunud adsorbendi loputamine.
6 ) Pange keeduklaas või Erlenmeyeri kolb kinnipaneku alla ja avage sulgemiskraan. Ühe kiire liigutusega keerutatakse ja valatakse ränidioksiidi või alumiiniumoksiidi läga kolonni, kasutades selleks suure suuga lehterit (joonis 5 a). Kasutage kohe rohkem eluaatorit, et loputada jääkmuda Erlenmeyeri kolvist välja (joonis 5 b) ja kolonnile.
7) Loputage kohe ränidioksiidi või alumiiniumoksiidi kolonni reservuaari külgedelt, kasutades eluaatorit ja Pasteur-pipeti keerutavaid liigutusi (joonised 5 c ja d). Kui adsorbendi lastakse kuivada, jääb see klaasi külge kinni ja seda ei ole lihtne maha loputada.
7) Loputage kohe ränidioksiidi või alumiiniumoksiidi kolonni reservuaari külgedelt, kasutades eluaatorit ja Pasteur-pipeti keerutavaid liigutusi (joonised 5 c ja d). Kui adsorbendi lastakse kuivada, jääb see klaasi külge kinni ja seda ei ole lihtne maha loputada.
a) Kolonni torkimine õhumullide eemaldamiseks, b) Õhusurve rakendamine, c) Liiva lisamine, d) Liiva loputamine külgedelt.
8) Torgake kolonni tugevalt korgirõnga või sõrmenukkidega (joonis 6 a), et eemaldada kolonnis olevad õhumullid (mis võivad põhjustada adsorbendi halba eraldumist või pragunemist kolonnis) ja soodustada adsorbendi ühtlast sadestumist.
9) Survestage kolonni (joonis 6 b) õrnalt kokku, lõpetades, kui eluendi tase on 1 cm kaugusel kolonni tipust. Kui õhuliiniga kasutatakse T-adapterit, nagu on näidatud joonisel 6 b, saab õhuvoolu peenreguleerimist teostada kummitoru pigistusklambri reguleerimise abil. Kogu elueerimisprotsessi vältel tuleb valge adsorbendi kolonn hoida niiskena, nii et elueendi tase on ränidioksiidi või alumiiniumoksiidi ülemisest osast kõrgemal. Rõhu rakendamise lõpetamiseks murdke õrnalt tihend ja sulgege sulgemiskraan, et vältida vedeliku edasist välja tilkumist.
10 ) Lisage õhuke, umbes 0,5 cm kõrgune liivakiht (joonis 6 c). Loputage kolonni küljed eluaatoriga, kasutades keerutavaid liigutusi, et liiv klaasi külgedelt eemalduks (joonis 6 d). Avage sulgemiskraan ja laske vedelikul välja tilkuda, kuni vedelik on just liivakihi kohal. Kui tilkumine on liiga aeglane, rakendage õhurõhku.
9) Survestage kolonni (joonis 6 b) õrnalt kokku, lõpetades, kui eluendi tase on 1 cm kaugusel kolonni tipust. Kui õhuliiniga kasutatakse T-adapterit, nagu on näidatud joonisel 6 b, saab õhuvoolu peenreguleerimist teostada kummitoru pigistusklambri reguleerimise abil. Kogu elueerimisprotsessi vältel tuleb valge adsorbendi kolonn hoida niiskena, nii et elueendi tase on ränidioksiidi või alumiiniumoksiidi ülemisest osast kõrgemal. Rõhu rakendamise lõpetamiseks murdke õrnalt tihend ja sulgege sulgemiskraan, et vältida vedeliku edasist välja tilkumist.
10 ) Lisage õhuke, umbes 0,5 cm kõrgune liivakiht (joonis 6 c). Loputage kolonni küljed eluaatoriga, kasutades keerutavaid liigutusi, et liiv klaasi külgedelt eemalduks (joonis 6 d). Avage sulgemiskraan ja laske vedelikul välja tilkuda, kuni vedelik on just liivakihi kohal. Kui tilkumine on liiga aeglane, rakendage õhurõhku.
Lisage proovi
Kui proov on kolonni kantud, algab võidujooks ajaga, sest difusioon hakkab materjali laialivalguma. Proovi ei tohiks lisada enne, kui olete valmis kolonni kohe ja täielikult valmis tegema. See protsess võib võtta aega 15-90 minutit! Kui fraktsioonide kogumiseks kasutatakse katseklaase, tuleb katseklaasid enne proovi lisamist paigutada riiulisse ja kolonni kõrgus reguleerida nii, et katseklaaside riiul saaks allapoole libiseda.
a) Tahke aine lahustamine väikese koguse diklorometaaniga, b) proovi pealekandmine, c) proovi loputamine kolvis, d) rõhu rakendamine, et suruda proov kolonnile vahetult pärast liivakihti.
11) Kui toorproov on vedelik, kasutatakse seda otse (jätkatakse sammuga 13).
12) Kui toorproov on tahke, tehke üks järgmistest toimingutest.
12) Kui toorproov on tahke, tehke üks järgmistest toimingutest.
a) Ideaalne olukord: lahustage tahke aine minimaalses koguses elueerijas (maksimaalselt mõned ml).
b) Kui tahke aine ei ole eriti lahustuv või ei lahustu mõnes ml elueerijas, lahustage see minimaalses koguses diklorometaanis (maksimaalselt mõnes ml, joonis 7 a).
c) Kui tahke aine ei lahustu elueerijas, on võimalik ka alternatiivne menetlus. Lahustage tahke aine ümarpõhjalises kolvis, kasutades mõned ml vähekeevitavat lahustit (nt diklorometaani või atsetooni). Kolbi lisatakse umbes 1 g ränidioksiidi või alumiiniumoksiidi, seejärel eemaldatakse lahusti pöörleva aurusti abil, et jätta tahke aine, mis sisaldab adsorbendi peale sadestunud proovi. Kui pakitud kolonni peal on tolli jagu eluaatorit (kui seda meetodit kasutatakse, jäetakse liivakihi lisamine vahele), valatakse ränidioksiidi adsorbeerunud proov kolonnile laia suuga lehviku abil. Kui klaasi külge jääb tolmu, loputage seda veel eluaatoriga (jätkake sammuga 15).
13) Lisage proov ettevaatlikult pipeti abil kolonnile, tilgutades vedelikku või lahust pipetiotsaga otse liivale nii lähedale kui võimalik, mitte külgedelt alla (joonis 7 b). Jälgige, et vedelikku ei pritsitaks vägivaldselt sisse, nii et liiva või ränidioksiidi/alumiiniumoksiidi kolonni tekiksid mõlgid.
14) Loputage proovikonteinerit vähese lahustiga (või diklorometaaniga, kui seda kasutatakse, joonis 7 c) ja lisage loputusvedelik samaga pipetile (et loputada ka pipetti).
15) Avage sulgemiskraan ja laske vedelikul välja tilkuda, kuni proov on just üle liivakihi (joonis 7 d) ja kolonni valgesse piirkonda (kui see võtab kauem kui 20 sekundit, rakendage õhurõhku).
16 ) Loputage kolonni külgi ettevaatlikult keerutavate liigutustega, kasutades 1-2 pipettitäit elueenti, et loputada pritsinud proovi. Jällegi laske vedelikul välja tilkuda (või rakendage õhurõhku), kuni proov on surutud valgesse adsorbendisse.
Kordage loputamist, kuni olete kindel, et kogu proov on adsorbendile ladestunud. Kui osa proovist on veel liivakihis, võib see lahusti lisamisel lahustisse lahustuda, mis viib saagise vähenemiseni. Kui ühend on värviline, peaks loputus olema täiesti selge.
14) Loputage proovikonteinerit vähese lahustiga (või diklorometaaniga, kui seda kasutatakse, joonis 7 c) ja lisage loputusvedelik samaga pipetile (et loputada ka pipetti).
15) Avage sulgemiskraan ja laske vedelikul välja tilkuda, kuni proov on just üle liivakihi (joonis 7 d) ja kolonni valgesse piirkonda (kui see võtab kauem kui 20 sekundit, rakendage õhurõhku).
16 ) Loputage kolonni külgi ettevaatlikult keerutavate liigutustega, kasutades 1-2 pipettitäit elueenti, et loputada pritsinud proovi. Jällegi laske vedelikul välja tilkuda (või rakendage õhurõhku), kuni proov on surutud valgesse adsorbendisse.
Kordage loputamist, kuni olete kindel, et kogu proov on adsorbendile ladestunud. Kui osa proovist on veel liivakihis, võib see lahusti lisamisel lahustisse lahustuda, mis viib saagise vähenemiseni. Kui ühend on värviline, peaks loputus olema täiesti selge.
a ja b) Lahusti reservuaari täitmine, c ja d) kolonni elueerimine
Täitmine elueerijaga ja kolonni eluteerimine
17) Lisage ettevaatlikult pipeti abil (joonis 8 a) rohkem eluaatorit, keerutades külgedel, ja kui liivakiht ei oleks enam lisamistega häiritud, valage ettevaatlikult suurem kogus (joonis 8 b) ettevalmistatud eluaatorit, et täita reservuaar (või täita nii palju, kui võib olla vaja). Kolonni pakkimise ajal kogutud puhast eluaatorit võib uuesti kasutada.
18 ) Kasutage õhurõhku, et proovi õrnalt ja ühtlaselt läbi kolonni elueerida (joonis 8 c ja d). Mida rohkem kordi rõhku käivitatakse ja peatatakse, seda tõenäolisemalt võib kolonn lõhkeda. Kõige parem on, kui rõhku saab kogu aeg hoida õrnalt ja ühtlaselt.
Optimaalne tilgutuskiirus elueerimise ajal sõltub kolonni suurusest. Ideaalne elueeriva aine voolu kiirus on siis, kui lahusti langeb kolonni silindrilise osa adsorbendi kohal 5 cm minutis. Seetõttu peaks tilgutuskiirus olema kitsas kolonni puhul aeglasem kui laiema kolonni puhul. Ühe tollise kolonni puhul peaks tilkumise kiirus olema selline, kus üksikud tilgad on vaevu eristatavad. Sellise suurusega kolonni puhul on sulgurikraanist välja voolav vedeliku voog veidi liiga kiire.
18 ) Kasutage õhurõhku, et proovi õrnalt ja ühtlaselt läbi kolonni elueerida (joonis 8 c ja d). Mida rohkem kordi rõhku käivitatakse ja peatatakse, seda tõenäolisemalt võib kolonn lõhkeda. Kõige parem on, kui rõhku saab kogu aeg hoida õrnalt ja ühtlaselt.
Optimaalne tilgutuskiirus elueerimise ajal sõltub kolonni suurusest. Ideaalne elueeriva aine voolu kiirus on siis, kui lahusti langeb kolonni silindrilise osa adsorbendi kohal 5 cm minutis. Seetõttu peaks tilgutuskiirus olema kitsas kolonni puhul aeglasem kui laiema kolonni puhul. Ühe tollise kolonni puhul peaks tilkumise kiirus olema selline, kus üksikud tilgad on vaevu eristatavad. Sellise suurusega kolonni puhul on sulgurikraanist välja voolav vedeliku voog veidi liiga kiire.
a-c) Fraktsioonide kogumine, d) kolonni käivitamine
Fraktsioonide kogumine
19) Alustage kohe elueeruva vedeliku kogumist katseklaasidesse rackil (joonis 9 a). Vaata joonisel 1 soovitusi igasse katseklaasi kogutavate mahtude kohta.20) Kui esimene katseklaas täitub või kui juhendaja või joonise 1 soovituse kohaselt on kogutud teatav kogus vedelikku, liigutage hammasratast, et alustada kogumist teise katseklaasi (joonis 9 b ja c). Täitke katseklaasid ja hoidke neid järjestikku riiulil.
Neid erinevaid torusid nimetatakse "fraktsioonideks". Kolonni eesmärk on koguda piisavalt väikeseid fraktsioone, et enamik (või mõned) fraktsioonid sisaldaksid puhast materjali. Kui segu eraldamine on raske (kui komponentide ΔRf on madal), võib olla kõige parem koguda väikseid fraktsioone (nt pooleldi täidetud torusid).
Neid erinevaid torusid nimetatakse "fraktsioonideks". Kolonni eesmärk on koguda piisavalt väikeseid fraktsioone, et enamik (või mõned) fraktsioonid sisaldaksid puhast materjali. Kui segu eraldamine on raske (kui komponentide ΔRf on madal), võib olla kõige parem koguda väikseid fraktsioone (nt pooleldi täidetud torusid).
a-c ) Kolonni otsa pritsitud loputusmaterjal, d) õpilased, kes juhivad kolonni
21 ) Kui vedelik kolonnist välja voolab, pritsib see sageli kolonni tipu väliskülgedele ja kui lahusti aurustub, võite te näha materjalirõngast kolonni tipul (kui komponent on tahke, nagu joonisel 10 b, siis näete tahkete ainete rõngast või kui komponent on vedelik, siis õliseid tilkasid). Kui komponendid on värvilised, tuleb kolonni otsikut loputada (joonis 10 c), kui tundub, et üks komponent on täielikult elueerunud ja enne teise komponendi lähenemist.
22 ) Jälgige perioodiliselt elueendi taset ja täitke seda uuesti, enne kui see langeb liivakihi alla.
22 ) Jälgige perioodiliselt elueendi taset ja täitke seda uuesti, enne kui see langeb liivakihi alla.
a) Elueerimine, b) etüülatsetaadi lisamine lahusti polaarsuse suurendamiseks, c) lahusti tase läheneb liivakihile, d) uuesti täitmine
Võimalik lahusti polaarsuse suurendamine
23) Kogu kolonni ulatuses võib kasutada ühte elueerijat, eriti kui eraldatavad komponendid on sarnaste Rf-väärtustega. Kui aga komponentidel on väga erinevad Rf-väärtused, võib lahusti polaarsust suurendada pärast seda, kui üks komponent on kolonnist elueerunud (joonis 11 a).
Lahusti polaarsuse suurendamine muudab komponentide liikumise "kiiremaks". Kiiremat elueerimist soovitakse mitmel põhjusel. Esiteks, kui üks komponent on juba kolonnist väljunud, on kolonn juba oma töö eraldamisega teinud, nii et protsessi kiirendamine ei mõjuta kogutud fraktsioonide puhtust. Teiseks, mida kauem kestab kolonn, seda laiemad on komponentide ribad (difusiooni tõttu) ja laia materjali kogumine kulutab (ja raiskab) palju lahustit.
Lahusti polaarsuse suurendamine muudab komponentide liikumise "kiiremaks". Kiiremat elueerimist soovitakse mitmel põhjusel. Esiteks, kui üks komponent on juba kolonnist väljunud, on kolonn juba oma töö eraldamisega teinud, nii et protsessi kiirendamine ei mõjuta kogutud fraktsioonide puhtust. Teiseks, mida kauem kestab kolonn, seda laiemad on komponentide ribad (difusiooni tõttu) ja laia materjali kogumine kulutab (ja raiskab) palju lahustit.
Sisaldab eluotroopsete seeriate osalist loetelu, mis on tavaliste lahustite loetelu, mis on järjestatud nende "lahustusvõime" järgi normaalfaasikromatograafias. Mida polaarsem lahusti põhjustab kõige järsemat Rf suurenemist
24 ) Lahusti polaarsuse suurendamiseks võib polaarset lahustit tilgutada otse kolonni reservuaari eluaatorisse (joonis 11 b). Näiteks heksaanide ja etüülatsetaadi segu kasutamisel suurendaks puhta etüülatsetaadi lisamine praegu reservuaaris olevale elueendile selle polaarsust. Kui elueendi tase on madal, võib valmistada lahuse, mis sisaldab suurema protsendi polaarsemat komponenti. Näiteks kui kolonnis kasutati esmalt 4:1 heksaanide ja etüülatsetaadi segu, oleks 1:1 segu kasutamine polaarsem lahusti.
25) Elueerige kolonn polaarsema lahustiga, nagu varemgi, ja pidage alati meeles, et jälgige eluendi taset ja täitke seda uuesti (joonis 11 d), enne kui see langeb liivakihi alla.
26 ) Lahusti polaarsuse suurendamiseks võib polaarset lahustit tilgutada otse kolonni reservuaari elueerijasse (joonis 11 b). Näiteks kui kasutatakse heksaanide ja etüülatsetaadi segu, suurendaks puhta etüülatsetaadi lisamine praegu reservuaaris olevale elueendile selle polaarsust. Kui elueendi tase on madal, võib valmistada lahuse, mis sisaldab suurema protsendi polaarsemat komponenti. Näiteks kui kolonnis kasutati esmalt 4:1 heksaanide ja etüülatsetaadi segu, oleks 1:1 segu kasutamine polaarsem lahusti.
27) Elueerige kolonn polaarsema lahustiga, nagu varemgi, ja pidage alati meeles, et jälgige eluendi taset ja täitke seda uuesti (joonis 11 d), enne kui see langeb liivakihi alla.
25) Elueerige kolonn polaarsema lahustiga, nagu varemgi, ja pidage alati meeles, et jälgige eluendi taset ja täitke seda uuesti (joonis 11 d), enne kui see langeb liivakihi alla.
26 ) Lahusti polaarsuse suurendamiseks võib polaarset lahustit tilgutada otse kolonni reservuaari elueerijasse (joonis 11 b). Näiteks kui kasutatakse heksaanide ja etüülatsetaadi segu, suurendaks puhta etüülatsetaadi lisamine praegu reservuaaris olevale elueendile selle polaarsust. Kui elueendi tase on madal, võib valmistada lahuse, mis sisaldab suurema protsendi polaarsemat komponenti. Näiteks kui kolonnis kasutati esmalt 4:1 heksaanide ja etüülatsetaadi segu, oleks 1:1 segu kasutamine polaarsem lahusti.
27) Elueerige kolonn polaarsema lahustiga, nagu varemgi, ja pidage alati meeles, et jälgige eluendi taset ja täitke seda uuesti (joonis 11 d), enne kui see langeb liivakihi alla.
a) Esialgne TLC-plaat, b) kolonni kogutud fraktsioonid, c) fraktsioonide määramine TLC-plaadile, d) visualiseeritud TLC-plaat iga fraktsiooni proovidest
Soovitud komponendi leidmine ja kontsentreerimine
28 ) Soovitud komponendi leidmisel katseklaasi fraktsioonidelt on kasulik mõista kolonnikromatograafias Rf ja elutsioonijärjekorra vahelist seost.Kolonnkromatograafias asetatakse proov kolonni ettepoole ja elueeritakse alla, samas kui õhukese kihi kromatograafias laotakse proov plaadi põhja ja elueeritakse ülespoole. Seetõttu võib kolonni vaadelda kui tagurpidi pööratud TLC-plaati. Kõrgema Rf-ga ühend jookseb "kiiremini", mis tähendab, et see jõuab TLC-plaadil kõrgemale ja kogutakse kolonniga esimesena. Käesolevas punktis kujutatud kolonnis on madalama Rf-ga komponent (oranž TLC-plaadil joonisel 13 a) see komponent, mis kogutakse kolonnist teisena.
29) Kõigepealt määratakse kindlaks, millised katseklaasid sisaldavad lahustunud ühendit.
29) Kõigepealt määratakse kindlaks, millised katseklaasid sisaldavad lahustunud ühendit.
a) Pistetakse igast fraktsioonist proov TLC-plaadile, mis on märgistatud fraktsioonide numbritega, mis vastavad nende kogumise järjekorrale (joonis 13 c). Võib olla kõige parem, kui iga proovi märgitakse 2-3 korda üksteise peale, juhul kui fraktsioonid on lahjendatud.
b) Kui on kogutud palju fraktsioone, mistõttu kõhklete igast fraktsioonist proovi võtmast, on üks meetod värvitute fraktsioonide tuvastamiseks, mis võivad sisaldada ühendit, otsida vihjeid jääkidest, mis viivad katseklaasidesse. Pärast aurustumist jääb mõnikord katseklaasi ülaosasse tahke jääk (joonis 13) või õlised tilgad, mis teeb ilmseks, et need fraktsioonid sisaldavad rohkem kui ainult lahustit. Võetakse proovid kõigist nähtavate jääkidega fraktsioonide läheduses olevatest katseklaasidest.
.
c) visualiseerige täpiline TLC-plaat, kasutades UV-valgust ja/või värvainet, et määrata kindlaks, millised fraktsioonid sisaldavad ühendit (joonis 13 d).
c) visualiseerige täpiline TLC-plaat, kasutades UV-valgust ja/või värvainet, et määrata kindlaks, millised fraktsioonid sisaldavad ühendit (joonis 13 d).
a) Võimalikku ühendit sisaldavate fraktsioonide elueeritud TLC-plaadid, b) Fraktsioonide ühendamine, c) Fraktsioonitoru loputamine.
28) Tehakse kõigi ühendit sisaldavate fraktsioonide TLC, määrates kuni viis proovi 2,5 cm laiuse TLC-plaadi kohta. Selleks võib kasutada laiemaid TLC-plaate, kui need on kättesaadavad.
29) Identifitseeritakse soovitud Rf-ga ühend, võrreldes seda algse toorplaadi TLC-plaadiga. Valida säilitatakse fraktsioonid, milles on soovitud ühend puhtal kujul, nagu näitab elueeritud TLC-plaat. Näiteks kui joonisel 15 a soovitakse kõrgema Rf-ga ühendit, tuleks säilitada fraktsioonid 6-10.
30) Ühendage puhtad fraktsioonid sobiva suurusega ümarpõhjalisse kolbi (mitte üle poole täis, joonis 15 b). Iga katseklaasi loputatakse väikese koguse eluaatoriga (või muu lahustiga, kui lahustuvus on probleemiks) ja loputus lisatakse ümarpõhjalisse kolbi (joonis 15 c).
31 ) Aurustage lahusti pöörleva aurustiga, et jätta kolbi puhastatud ühend.
29) Identifitseeritakse soovitud Rf-ga ühend, võrreldes seda algse toorplaadi TLC-plaadiga. Valida säilitatakse fraktsioonid, milles on soovitud ühend puhtal kujul, nagu näitab elueeritud TLC-plaat. Näiteks kui joonisel 15 a soovitakse kõrgema Rf-ga ühendit, tuleks säilitada fraktsioonid 6-10.
30) Ühendage puhtad fraktsioonid sobiva suurusega ümarpõhjalisse kolbi (mitte üle poole täis, joonis 15 b). Iga katseklaasi loputatakse väikese koguse eluaatoriga (või muu lahustiga, kui lahustuvus on probleemiks) ja loputus lisatakse ümarpõhjalisse kolbi (joonis 15 c).
31 ) Aurustage lahusti pöörleva aurustiga, et jätta kolbi puhastatud ühend.
a) kolonni kuivatamine õhurõhu abil, b) kolonni tagurpidi kuivatamise võimaldamine, c) ränijäätmete kogumine.
Kolonni puhastamine
32 ) Kolonni kuivatamiseks kasutage õhurõhku, et tühjendada suurem osa kolonni elueerivast ainest jäätmekonteinerisse. Seejärel kuivatage kolonn edasi, kasutades ühte neist meetoditest.
a) Jätke kolonni edasiseks kuivatamiseks ühendatud õrn õhuvool läbi kolonni voolama, kui puhastate muid asju (joonis 16 a).
b) Klammerdage kolonn tagurpidi suure jäätmeklaasi kohale suitsutuskapis, nii et adsorbent langeb pärast kuivatamist alla (joonis 16 b). See võtab kaua aega (kuni järgmise tunnini), kuid on üks võimalus.
33 ) Kui adsorbent on kuivanud, võib adsorbendi kolonnist välja valada suitsutuskapis olevasse jäätmekonteinerisse (joonis 16 c).
Ohutusalane märkus: pulbrilised adsorbendid on kopsuärritavad ja nende ohtlikkus suureneb, kui kolonn sisaldab jääkühendeid, mis võivad nüüd kopsudesse sattuda. Ränidioksiidi või alumiiniumoksiidi pulbrite valamine peab alati toimuma suitsulõõris.
34 ) Kui suurem osa adsorbendist on kogutud jäätmekonteinerisse, loputage vee abil kõik tahke ainejäägid kraanikaussi ja seejärel loputage kolonn atsetooniga jäätmeklaasi. Edasi puhastage kolonn seebi ja veega ning kuivatage see, kusjuures sulguri osad eraldatakse.
Ohutusalane märkus: pulbrilised adsorbendid on kopsuärritavad ja nende ohtlikkus suureneb, kui kolonn sisaldab jääkühendeid, mis võivad nüüd kopsudesse sattuda. Ränidioksiidi või alumiiniumoksiidi pulbrite valamine peab alati toimuma suitsulõõris.
34 ) Kui suurem osa adsorbendist on kogutud jäätmekonteinerisse, loputage vee abil kõik tahke ainejäägid kraanikaussi ja seejärel loputage kolonn atsetooniga jäätmeklaasi. Edasi puhastage kolonn seebi ja veega ning kuivatage see, kusjuures sulguri osad eraldatakse.
Veaotsing
Kolonnis on näha õhumulle
Õhumull on tühi tasku, kus statsionaarse ja liikuva faasi tasakaalustamine ei toimu, mistõttu komponendid liiguvad õhumulli ümber kiiremini kui peaksid. See võib põhjustada ebaühtlase elueerumise ribasid, mis võib põhjustada kattumist, kui segu eraldamine on raske (kui komponentidel on väga lähedased Rf-väärtused, nagu joonisel 17).
Kui kolonnis on näha õhumulle ja liiva või proovi ei ole veel peale kantud, tuleb kolonni pakkimise ajal korralikult torgata, et eemaldada kõik õhumullid. Kui mullid ei liigu, pöörduge oma juhendaja poole, sest võib-olla lähenete ülesandele liiga delikaatselt. Kui liiv või proov on juba peale kantud, on kõige parem jätta kolonn selliseks, nagu see on, ja loota, et õhumullid ei mõjuta eraldamist.
Ribad elueeruvad ebaühtlaselt
Kui segu komponendid on värvilised, võib see ilmneda, kui ribad elueeruvad kõveralt. See on tõenäoliselt tingitud sellest, et kolonn on veidi diagonaalselt kinni pandud. Kui kolonn on klammerdatud kaldus, liiguvad komponendid kaldus suunas (joonis 18). See võib põhjustada eraldumisprobleeme, kui komponentidel on sarnane Rf.
Seda probleemi ei ole võimalik lahendada keset kolonni, kuid kui komponentidel on väga erinevad Rf väärtused, ei pruugi viltused ribad mõjutada eraldumist. Tulevikus kontrollige kindlasti, et kolonn oleks täiesti vertikaalne nii külg-üles- kui ka ees-taha suunas.
Last edited by a moderator:
