Cromatografía en columna (flash)

[G.Patton]

Introducción

La cromatografía en columna es una extensión de la cromatografía en capa fina (TLC). Se supone que el lector tiene cierta experiencia en la práctica de laboratorio y ha tratado con la cromatografía en capa fina. En lugar de aplicar una muestra sobre una fina capa de sílice o alúmina, la muestra se deposita sobre un cilindro de adsorbente y el disolvente se aplica continuamente con presión hasta que los componentes drenan completamente del cilindro. Con esta modificación, los componentes no sólo se pueden separar, sino que se pueden recoger en distintos recipientes, lo que permite purificar mezclas y separar fármacos contaminados. La cromatografía en columna (también conocida como "cromatografía flash"), se utiliza con frecuencia en entornos de investigación, como lo demuestra su frecuente aparición en las secciones de procedimiento de los artículos de revistas.

Discusión del procedimiento

Los mismos principios subyacentes de la cromatografía en capa fina (TLC) se aplican a la cromatografía en columna. De hecho, siempre se realiza una TLC antes de realizar una columna para evaluar la situación y determinar la proporción de disolvente adecuada. Para obtener una buena separación, lo ideal es que el componente deseado tenga un Rf en torno a 0,35 (lea sobre Rf en el tema de la TLC) y esté separado de otros componentes por al menos 0,2 unidades Rf. Si las manchas a separar están muy próximas (si la diferencia de Rf es < 0,2), lo mejor es que la media de las manchas tenga un Rf de 0,35. Un Rf cercano a 0,35 es ideal porque es lo suficientemente lento como para que pueda producirse el equilibrio entre la fase estacionaria y la fase móvil, pero lo suficientemente rápido como para minimizar el ensanchamiento de la banda debido a la difusión.

Hay algunas variables que no son aplicables a la TLC, pero que afectan a la separación de componentes en la cromatografía en columna. Entre ellas se incluyen el diámetro de la columna, la cantidad de adsorbente utilizado y el caudal de disolvente. La fig. 1 muestran recomendaciones variables en función del tamaño de la muestra y del grado de separación entre componentes. En todos los casos, las columnas deben prepararse a una altura de entre 12,5 y 15 cm.

Spoiler:Fig . 1 Resumen de los valores recomendados para la cromatografía en columna

Por ejemplo, una columna de 2,5 cm debería poder purificar unos 400 mg de material si la separación es buena (ΔRf > 0,2, tercera columna de la fig. 1), o unos 160 mg si la separación es difícil (ΔRf > 0,1). La columna debería poder prepararse y eluirse utilizando unos 200 ml de disolvente, y las fracciones pueden recogerse con aproximadamente 10 ml de solución cada una.

Existen múltiples variaciones sobre cómo hacer funcionar físicamente una columna. Una gran diferencia en los métodos es cómo se prepara la columna. En el método de "empaquetado en seco", se añade sílice o alúmina seca directamente a una columna y se deja que el disolvente pase en porciones, después con presión. En el método de "empaquetado en húmedo", primero se llena la columna con disolvente, después se agita ligeramente la sílice o alúmina seca y, por último, se empaqueta a presión. En el método del "lodo", se añade disolvente a la sílice o alúmina en un matraz Erlenmeyer, se vierte en la columna como un lodo y, a continuación, se empaqueta con presión (la presión puede producirse con una jeringa).

Es importante saber que se libera calor cuando se añade disolvente a la sílice o la alúmina (tienen un calor de solvatación exotérmico). En esta sección se presenta el método de la suspensión, cuya razón principal es que permite que este paso exotérmico se produzca en un matraz Erlenmeyer en lugar de en la columna. Si se libera calor durante el empaquetado de la columna, pueden generarse burbujas procedentes de la ebullición del disolvente. Éstas pueden interferir en la separación de la columna si no se eliminan adecuadamente, y pueden agrietar el material adsorbente de la columna.

Procedimientos paso a paso

Spoiler: Fig. 2

a) TLC de la mezcla ferroceno/acetilferroceno, b) Cromatografía en columna

La columna ilustrada en esta sección muestra la purificación de una muestra de 0,20 g que contiene una mezcla de ferroceno y acetilferroceno (la TLC en bruto aparece en la Fig.2 a). Se recogieron fracciones de unos 8 ml en pequeños tubos de ensayo y se utilizaron unos 400 ml de eluyente.

Spoiler:Fig. 3

a) Placa de TLC de la mezcla cruda de ferroceno/acetilferroceno antes de la elución, b) Después de la elución, c) Columna con frita, d) Columna con algodón encajado en el fondo, e) Columna sin la cuña de algodón (habría que insertarla antes de usarla).

Ejecutar una TLC

1 ) Realizar una TLC sobre la muestra a purificar (Fig.3 a y b) para determinar el disolvente apropiado para la cromatografía. El componente deseado debe tener un Rf en torno a 0,35 e idealmente debe estar separado de todos los demás puntos por al menos 0,2 unidades Rf.

2) Preparar un lote de eluyente que dé el valor Rf adecuado. La cantidad preparada depende de la cantidad de muestra, del tamaño de la columna y de si está previsto cambiar la composición del disolvente a mitad de camino. (Véanse las directrices en la Fig. 1 y las tendencias de la "potencia del disolvente" en la serie eluotrópica).

Preparar la columna empaquetada

3) Obtenga una columna adecuada (véase la Fig. 1), y asegúrese de que hay algo cerca de la llave de paso que permita el paso de líquido, pero no de sólidos. Las columnas pueden tener un disco sinterizado (también conocido como "frita"), Fig.3 c), o un tapón de algodón o lana de vidrio que haya quedado del usuario anterior (Fig.3 d). Si no hay disco ni tapón (Fig.3 e), introduzca un pequeño trozo de algodón o lana de vidrio en el fondo de la columna con una varilla larga.

Spoiler:Fig .4

a ) Vertido de sílice a 12,5-15 cm de altura en la campana extractora, b) Vertido de sílice en un matraz Erlenmeyer, c y d) Formación de una pasta

4) Fija tu columna perfectamente vertical a un soporte anular o enrejado, sujetándola con abrazaderas de tres dedos en dos puntos. En la campana extractora, vierta gel de sílice o adsorbente de alúmina en la columna hasta una altura de entre 12,5 y 15 cm (Fig.4 a).

Nota de seguridad: La sílice en polvo y la alúmina son irritantes para los pulmones y deben manipularse siempre con cuidado en una campana extractora. El polvo derramado debe eliminarse fregándolo con una toalla de papel húmeda (si está húmeda, las partículas finas son menos dispersivas).

5) En la campana de humos, vierta el adsorbente medido en la columna en un matraz Erlenmeyer (Fig.4 b) y, a continuación, añada un poco de eluyente (Fig.4 c). Haga una pasta suelta agitando y removiendo con una varilla de vidrio (Fig.4 d) hasta que todo el adsorbente esté completamente mojado, se desprendan burbujas de gas y la consistencia sea algo espesa, pero vertible.

Spoiler:Fig .5

a ) Vertido de la suspensión en la columna, b) Enjuague del matraz, c) Adsorbente adherido a las paredes de la columna, d) Enjuague del adsorbente adherido.

6) Coloque un vaso de precipitados o un matraz Erlenmeyer debajo de la columna sujeta y abra la llave de paso. Con un movimiento rápido, agite y vierta la suspensión de sílice o alúmina en la columna utilizando un embudo de boca grande (Fig. 5 a). Utilizar inmediatamente más eluyente para enjuagar la lechada residual del matraz Erlenmeyer (Fig.5 b) y verterla en la columna.

7) Enjuagar inmediatamente cualquier resto de sílice o alúmina de las paredes del depósito de la columna utilizando el eluyente y un movimiento giratorio de una pipeta Pasteur (Fig. 5 c y d). Si se deja secar, el adsorbente se adherirá al vidrio y no se enjuagará fácilmente.

Spoiler:Fig .6

a ) Empujando la columna para eliminar las burbujas de aire, b) Aplicando presión de aire, c) Añadiendo arena, d) Aclarando la arena de los lados

8) Golpee firmemente la columna con un anillo de corcho o con los nudillos (Fig. 6 a) para desalojar las burbujas de aire de la columna (que podrían provocar una mala separación o el agrietamiento del adsorbente en la columna) y para favorecer una deposición uniforme del adsorbente.

9) Aplique una ligera presión de aire en la parte superior de la columna (Fig. 6 b) para comprimirla, deteniéndose cuando el nivel de eluyente esté a 1 cm de la parte superior de la columna. Si se utiliza un adaptador en T con la tubería de aire como en la Fig.6 b, se puede realizar un control fino del flujo de aire ajustando la abrazadera de apriete de la tubería de goma. Durante todo el proceso de elución, mantenga húmeda la columna blanca de adsorbente, con el nivel de eluyente por encima de la parte superior de la sílice o alúmina. Rompa suavemente el precinto para dejar de aplicar presión y cierre la llave de paso para evitar que siga goteando líquido.

10) Añadir una fina capa de arena (Fig.6 c), de aproximadamente 0,5 cm de altura. Enjuagar las paredes de la columna con el eluyente mediante un movimiento giratorio para desprender la arena de las paredes del vaso (Fig.6 d). Abrir la llave de paso y dejar que gotee líquido hasta que éste se encuentre justo por encima de la capa de arena. Aplique presión de aire si el goteo es demasiado lento.

Añadir la muestra

Una vez aplicada la muestra a la columna, se inicia una carrera contra el tiempo, ya que la difusión comenzará a ensanchar el material. No se debe aplicar la muestra hasta que se esté preparado para completar la columna inmediatamente y en su totalidad. Este proceso puede durar entre 15 y 90 minutos. Si se utilizan tubos de ensayo para recoger fracciones, los tubos de ensayo deben colocarse en una gradilla antes de añadir la muestra, y la altura de la columna debe ajustarse de modo que la gradilla pueda deslizarse por debajo.

Spoiler: Fig. 7

a ) Disolución de un sólido con una pequeña cantidad de diclorometano, b ) Aplicación de la muestra, c ) Enjuague de la muestra en su matraz, d) Aplicación de presión para empujar la muestra sobre la columna justo después de la capa de arena.

11 ) Si la muestra bruta es líquida, utilizarla directamente (pasar a la etapa 13).

12) Si la muestra bruta es un sólido, haga una de las siguientes cosas.

a) Situación ideal: disolver el sólido en la cantidad mínima de eluyente (unos pocos ml como máximo).

b ) Si el sólido no es particularmente soluble, o no se disuelve en algunos ml de eluyente, disolverlo en la cantidad mínima de diclorometano (algunos ml como máximo, Fig.7 a).

c) Si el sólido es insoluble en el eluyente, también es posible un procedimiento alternativo. Disolver el sólido en un matraz de fondo redondo con algunos ml de un disolvente de bajo punto de ebullición (por ejemplo, diclorometano o acetona). Añada al matraz aproximadamente 1 g de sílice o alúmina y, a continuación, elimine el disolvente en el rotavapor para dejar un sólido que contenga la muestra depositada en el adsorbente. Con una pulgada de eluyente reposando sobre la columna empaquetada (omitir la adición de la capa de arena si se utiliza este método), verter la muestra adsorbida en sílice sobre la columna utilizando un embudo de boca ancha. Si queda polvo adherido al vidrio, enjuáguelo con más eluyente (vaya al paso 15).

13) Añada delicadamente la muestra a la columna mediante una pipeta, goteando el líquido o la solución directamente sobre la arena con la punta de la pipeta lo más cerca que pueda, no por los lados (Fig.7 b). Tenga cuidado de no verter el líquido a la fuerza de forma que se produzcan hendiduras en la arena o en la columna de sílice/alúmina.

14) Enjuagar el recipiente de la muestra con un poco de disolvente (o diclorometano si se utiliza, Fig.7 c) y añadir el enjuague a la columna utilizando la misma pipeta (para enjuagar también la pipeta).

15) Abrir la llave de paso y dejar que el líquido gotee hasta que la muestra sobrepase la capa de arena (Fig.7 d) y entre en la zona blanca de la columna (aplicar presión de aire si esto lleva más de 20 segundos).

16) Enjuague suavemente los lados de la columna con un movimiento giratorio utilizando 1-2 pipetas llenas de eluyente para enjuagar cualquier salpicadura de muestra. De nuevo, deje que el líquido gotee (o aplique presión de aire) hasta que la muestra se introduzca en el adsorbente blanco.

Repita el paso de aclarado hasta que esté seguro de que toda la muestra se ha depositado en el adsorbente. Si queda algo de muestra en la capa de arena, puede disolverse en el eluyente al añadir más disolvente, lo que provocaría una pérdida de rendimiento. Si el compuesto es coloreado, el enjuague debe ser completamente transparente.

Spoiler: Fig. 8

a y b) Llenado del depósito de disolvente, c y d) Elución de la columna

Llenarcon eluyente y eluir la columna

17) Añadir delicadamente más eluyente mediante pipeta (Fig.8 a), agitando por los lados, y luego, cuando la capa de arena ya no se altere con las adiciones, verter cuidadosamente cantidades mayores (Fig.8 b) del eluyente preparado para llenar el depósito (o llenar con la cantidad que sea necesaria). El eluyente limpio recogido durante el empaquetado de la columna puede reutilizarse.

18) Utilizar presión de aire para eluir la muestra de forma suave y constante a través de la columna (Fig.8 c y d). Cuantas más veces se inicie y detenga la presión, más probable es que la columna se agriete. Lo mejor es que la presión se mantenga suave y constante todo el tiempo.

La velocidad óptima de goteo durante la elución depende del tamaño de la columna. El flujo ideal de eluyente es cuando el disolvente en la sección cilíndrica de la columna por encima del adsorbente desciende a 5 cm por minuto. Por lo tanto, la velocidad de goteo debería ser menor con una columna estrecha que con una columna más ancha. La velocidad de goteo para una columna de una pulgada debe ser tal que apenas puedan distinguirse las gotas individuales. Un chorro de líquido saliendo por la llave de paso con este tamaño de columna es ligeramente demasiado rápido.

Alerón: Fig. 9

a-c) Recogida de fracciones, d) Funcionamiento de una columna

Recoger fracciones

19) Recoger inmediatamente el líquido de elución en tubos de ensayo colocados en una gradilla (Fig.9 a). Véanse en la Fig.1 las recomendaciones sobre los volúmenes a recoger en cada tubo de ensayo.

20) Cuando el primer tubo de ensayo se llene, o si se ha recogido una cierta altura de líquido según lo recomendado por su instructor o la Fig.1, mueva la gradilla para comenzar a recoger en un tubo diferente (Fig.9 b y c). Llene los tubos y manténgalos en orden en la gradilla.

Estos tubos diferentes se denominan "fracciones". El objetivo de una columna es recoger fracciones lo suficientemente pequeñas como para que la mayoría (o algunas) de las fracciones contengan material puro. Si la separación de la mezcla es difícil (si la ΔRf de los componentes es baja), puede ser mejor recoger fracciones pequeñas (por ejemplo, tubos llenos hasta la mitad).

Spoiler: Fig. 10

a-c ) Material de enjuague salpicado en la punta de la columna, d) Estudiantes haciendo funcionar una columna.

21) A medida que el líquido escurre de la columna, a menudo salpica en la parte exterior de la punta de la columna, y cuando el disolvente se evapora se puede ver un anillo de material en la punta (se verá un anillo de sólido si el componente es un sólido como en la Fig.10 b, o gotitas aceitosas si el componente es un líquido). Si los componentes son coloreados, la punta de la columna debe enjuagarse (Fig.10 c) cuando parezca que un componente ha eluido completamente y antes de que se aproxime el otro componente.

22) Vigilar periódicamente el nivel de eluyente y rellenar antes de que descienda por debajo de la capa de arena.

Spoiler: Fig. 11

a) Elución, b) Adición de acetato de etilo para aumentar la polaridad del disolvente, c ) El nivel de disolvente se acerca a la capa de arena, d) Rellenado

Posible aumento de la polaridad del disolvente

23) Puede utilizarse un mismo eluyente en toda la columna, especialmente si los componentes a separar tienen valores Rf similares. Sin embargo, si los componentes tienen valores Rf muy diferentes, puede aumentarse la polaridad del disolvente después de que un componente haya eluido de la columna (Fig.11 a).

Aumentar la polaridad del disolvente hará que los componentes se desplacen "más rápido". Hay varias razones por las que se desea una elución más rápida. En primer lugar, si un componente ya ha salido de la columna, ésta ya ha hecho su trabajo de separación, por lo que acelerar el proceso no afectará a la pureza de las fracciones recogidas. En segundo lugar, cuanto más se tarde en hacer funcionar una columna, más anchas serán las bandas de componentes (debido a la difusión), y recoger una banda ancha de material utilizará (y desperdiciará) mucho disolvente.

Spoiler: Fig. 12

Contiene una lista parcial de las series eluotrópicas, una lista de disolventes comunes clasificados según su "poder disolvente" en cromatografía de fase normal. El disolvente más polar provoca el aumento más drástico de Rf

24) Para aumentar la polaridad del disolvente, se puede gotear el disolvente polar directamente en el eluyente en el depósito de la columna (Fig.11 b). Por ejemplo, si se utiliza una mezcla de hexanos:acetato de etilo, la adición de acetato de etilo puro al eluyente actualmente en el depósito aumentaría su polaridad. Si el nivel de eluyente se está agotando, se podría preparar una solución que contenga un mayor porcentaje del componente más polar. Por ejemplo, si la columna utilizó primero una mezcla 4:1 de hexanos:acetato de etilo, utilizar una mezcla 1:1 sería un disolvente más polar.

25 ) Eluir la columna con el disolvente más polar como antes, y recordar siempre vigilar el nivel de eluyente, y rellenar (Fig.11 d) antes de que caiga por debajo de la capa de arena.

26) Para aumentar la polaridad del disolvente, se puede gotear el disolvente polar directamente en el eluyente del depósito de la columna (Fig.11 b). Por ejemplo, si se utiliza una mezcla de hexanos:acetato de etilo, la adición de acetato de etilo puro al eluyente actualmente en el depósito aumentaría su polaridad. Si el nivel de eluyente se está agotando, se podría preparar una solución que contenga un mayor porcentaje del componente más polar. Por ejemplo, si la columna utilizó primero una mezcla 4:1 de hexanos:acetato de etilo, utilizar una mezcla 1:1 sería un disolvente más polar.

27) Eluir la columna con el disolvente más polar como antes, y recordar siempre vigilar el nivel de eluyente, y rellenar (Fig.11 d) antes de que caiga por debajo de la capa de arena.

Spoiler:Fig .13

a ) Placa de TLC original, b) Fracciones recogidas por la columna, c) Manchado de fracciones en una placa de TLC, d) Una placa de TLC visualizada de muestras de cada fracción.

Encontrary concentrar el componente deseado

28) Para encontrar el componente deseado en las fracciones del tubo de ensayo, es útil comprender la relación entre el Rf y el orden de elución en la cromatografía en columna.

En la cromatografía en columna, la muestra se deposita encabezando la columna y se eluye hacia abajo, mientras que en la cromatografía en capa fina, la muestra se deposita en el fondo de la placa y se eluye hacia arriba. Por lo tanto, una columna puede considerarse como una placa de cromatografía en capa fina invertida. Un compuesto con un Rf más alto corre "más rápido", lo que significa que terminará más arriba en una placa de TLC y se recogerá primero con una columna. En la columna ilustrada en esta sección, el componente con el Rf más bajo (naranja en la placa TLC de la Fig.13 a), es el componente recogido en segundo lugar en la columna.

29) Determine primero qué tubos de ensayo contienen compuesto disuelto.

a) Coloque una muestra de cada fracción en una placa de TLC etiquetada con los números de fracción correspondientes al orden en que se recogieron (Fig.13 c). Puede ser mejor colocar cada muestra 2-3 veces una encima de la otra en caso de que las fracciones estén diluidas.

b) Si se han recogido muchas fracciones, lo que le hace dudar de tomar muestras de cada fracción, un método para identificar las fracciones incoloras que pueden contener compuesto es buscar un indicio de residuo que encabece los tubos de ensayo. Tras la evaporación, a veces queda un residuo sólido (Fig.13) o gotitas aceitosas en la parte superior del tubo de ensayo, lo que hace evidente que esas fracciones contienen algo más que disolvente. Toma muestras de todas las fracciones cercanas a los tubos que contengan residuos visibles.

Spoiler:Fig. 14 Anillo de sólido visto en el borde de los tubos tras la evaporación

c) Visualice la placa de TLC manchada utilizando luz UV y/o una tinción para determinar qué fracciones contienen compuesto (Fig.13 d)

Spoiler: Fig. 15

a ) Placas de TLC eluidas de fracciones que contienen un posible compuesto, b) Combinación de fracciones, c) Enjuague de un tubo de fracción

28) Realizar una TLC de todas las fracciones que contengan compuesto, manchando hasta cinco muestras por placa de TLC de 2,5 cm de ancho. Si se dispone de placas de TLC más anchas, pueden utilizarse para este fin.

29) Identifique el compuesto con el Rf deseado comparándolo con la placa de TLC cruda original. Opte por retener las fracciones que contengan el compuesto deseado en forma pura, como lo demuestra la placa de TLC eluida. Por ejemplo, si se desea el compuesto con el Rf más alto en la Fig.15 a, deben conservarse las fracciones 6-10.

30) Combinar las fracciones puras en un matraz de fondo redondo de tamaño apropiado (no más de la mitad, Fig.15 b). Enjuagar cada tubo de ensayo con una pequeña cantidad de eluyente (u otro disolvente si la solubilidad es un problema), y añadir el enjuague al matraz de fondo redondo (Fig.15 c).

31) Evaporar el disolvente en el rotavapor para dejar el compuesto purificado en el matraz.

Spoiler:Fig .16

a ) Utilizando aire a presión para secar la columna, b) Dejando que la columna se seque boca abajo, c) Recogiendo la sílice residual.

Limpieza dela columna

32) Para secar la columna, aplique presión de aire para drenar la mayor parte del eluyente de la columna a un contenedor de residuos. A continuación, siga secando la columna utilizando uno de estos métodos.

a) Deje conectada una suave corriente de aire a través de la columna para secarla aún más mientras limpia otras cosas (Fig.16 a).

b ) Sujete la columna boca abajo sobre un vaso de precipitados grande en la campana extractora, para que el adsorbente caiga cuando se haya secado (Fig.16 b). Esto llevará mucho tiempo (hasta el siguiente periodo de clase), pero es una opción.

33) Una vez seco, el adsorbente puede verterse fuera de la columna en un contenedor de residuos de la campana extractora (Fig.16 c).

Nota de seguridad: Los adsorbentes en polvo son irritantes para los pulmones, y su peligro se agrava si la columna contiene compuestos residuales que ahora pueden llegar a los pulmones. El vertido de polvos de sílice o alúmina debe realizarse siempre en la campana extractora.

34) Cuando la mayor parte del adsorbente se haya recogido en un contenedor de residuos, utilice agua para enjuagar cualquier sólido residual en el fregadero y, a continuación, enjuague la columna con acetona en un vaso de precipitados de residuos. A continuación, limpie la columna con agua y jabón y séquela con las partes de la llave de paso separadas.

Solución de problemas

Se ven burbujas de aire en la columna

Una burbuja de aire es una bolsa vacía en la que no se produce el equilibrio entre la fase estacionaria y la fase móvil, por lo que los componentes se mueven más rápido de lo debido alrededor de una burbuja de aire. Esto puede dar lugar a bandas de elución desiguales, que pueden solaparse si la separación de la mezcla es difícil (si los componentes tienen valores Rf muy próximos, como en la Fig.17).

Spoiler:Fig . 17 Efecto de una burbuja de aire en la separación en una columna

Si se observan burbujas de aire en la columna y aún no se ha aplicado la arena o la muestra, dé un buen empujón a la columna durante el empaquetado para eliminar todas las burbujas de aire. Consulte a su instructor si las burbujas no ceden, ya que puede estar abordando la tarea con demasiada delicadeza. Si ya se ha aplicado la arena o la muestra, es mejor dejar la columna tal como está y esperar que las burbujas de aire no afecten a la separación.

Las bandas eluyen de forma desigual

Si los componentes de una mezcla son coloreados, puede ser obvio cuando las bandas eluyen de forma torcida. Lo más probable es que esto se deba a que la columna está sujeta en una ligera diagonal. Si la columna se sujeta de forma inclinada, los componentes se desplazarán de forma inclinada (Fig. 18). Esto puede causar problemas de separación si los componentes tienen un Rf similar.

Alerón:Fig . 18 Efecto de una columna torcida en la separación

No hay forma de resolver este problema a mitad de una columna, pero si los componentes tienen valores de Rf muy diferentes, es posible que las bandas inclinadas no tengan ningún efecto sobre la separación. En el futuro, asegúrese de comprobar que la columna está perfectamente vertical tanto en la dirección de lado a lado como de delante hacia atrás.

 

[davlovsky]

Así, mientras eluimos la muestra, la polaridad del eluyente va a decidir qué moléculas de la muestra absorberá el eluyente y luego recogerá en su serie de tubos de ensayo. Pero el punto de corte parece un poco "impreciso", es decir, la diferencia de RF entre un tubo de ensayo y el siguiente podría ser relativamente pequeña, y si aún no conoces el valor de RF asociado a la combinación muestra-eluyente, ¿cómo sabes qué tubos de ensayo contienen qué?

En los vídeos que he visto, empezaban con muestras básicamente puras, sobre las que realizaban su TLC obteniendo sus valores de RF, de modo que a medida que hacían su cromatografía en columna, podían hacer más TLC en cada tubo de ensayo para averiguar qué tubo de ensayo contenía qué, pero, de nuevo, si no se tiene alguna referencia de valor de RF, ¿cómo se procedería?

¿Están estos valores de RF recogidos en la bibliografía? Por ejemplo, en la síntesis de LSD, te dan la composición del eluyente (mezcla 3:1 C6H6/CHCl3), pero ningún valor de RF asociado a esa combinación LSD-eluyente. ¿Es que ya saben (por ensayo y error o por cálculos más avanzados) que la mezcla 3:1 C6H6/CHCl3 dará como resultado un valor de RF de 0,35 para una muestra de LSD freebase?

 

[Sue]

Para los lisérgidos suelen utilizar un UV (luz negra) para ver/seguir las bandas y gotas que salen de la columna...