Anotace: V knize jsou popsány chemické látky, které se používají v chemickém průmyslu.
Provedení studie prozánětlivých účinků mefedronu a identifikace jeho etologických vlastností jsou povinnou fází výzkumu 4-MMC, který je považován za jednu z nejoblíbenějších psychoaktivních látek z hlediska rekreačního užívání. Podání, transport a koncentrace mefedronu v jeho cílových tkáních závisí nejen na podané dávce, ale také na řadě dalších faktorů - distribuci látky, stupni a rychlosti absorpce, způsobu metabolismu a vylučování. V průběhu studie je důležité stanovit podíl látky distribuované v cílových tkáních nebo biologických tekutinách, s nimiž je transportována, takže lze zjistit, která část podané látky podléhá biotransformaci a která část se dostává do systémového krevního oběhu v nezměněné podobě. Ve fázi preklinického testování je také kromě studia hlavních mechanismů účinku potřeba provést rozsáhlý fenotypový screening, který je nezbytný pro důkladné pochopení farmakodynamiky a vedlejších účinků látky. Jedním z důležitých aspektů takového screeningu je studium psychoaktivních vlastností látky.
Cíle studie.
1. Stanovit kognitivní motivační a behaviorální vzorce u potkanů, kterým byl podáván 4-methylmethkathinon.
2. Studovat endoteliální funkci prováděním vaskulárních farmakologických testů s využitím blokády NO-syntézy pod ultrazvukovou kontrolou rychlosti krevního průtoku ve femorální tepně potkana a laserovou dopplerovskou flowmetrií monitorující celkovou hemodynamiku a rychlost mikrocirkulace v mediálním svalu.
3. Identifikace a vyhodnocení prozánětlivých a imunoregulačních aktivit 4-methylmetkatinonu pomocí modelu formalinem indukovaného edému tlapky a NBT testu.
Materiály a metody: 1.
Studie byla provedena na 40 samcích potkanů kmene Wistar o hmotnosti 180-200 g. Byly stanoveny 4 skupiny: 1) Kontrolní skupina (intaktní potkani); 2) Potkani, kterým byl podáván mefedron intraperitálně každých 48 hodin v dávce 5 mg/kg rozpuštěné v roztoku NaCl 0,9 (0,5 ml). 3) Potkani, kterým byl mefedron podáván perorálně (přes zkumavku) každých 48 hodin v dávce 5 mg/kg rozpuštěné v roztoku NaCl 0,9 (0,5 ml). 4) Potkani, kterým byl podáván mefedron intraperitoneálně každých 48 hodin v dávce 5 mg/kg rozpuštěné v roztoku NaCl 0,9 (0,5 ml) před podáním formalínu pro model formalínem indukovaného edému tlapky.
Popis studie a diskuse.
Stanovení kognitivních motivačních a behaviorálních vzorců u potkanů, kterým byl podáván 4-methylmethkathinon. Pro dosažení tohoto cíle byly formulovány následující cíle: posoudit vliv 4-methylmethkathinonu na úroveň vzrušení, úzkosti a odolnosti vůči stresu u potkanů. Ke zjištění psychoemocionálního stavu studovaných zvířat jsme použili vylepšený protokol Hallova testu, který spočívá v umístění předmětu do standardizované arény a registraci ukazatelů aktivity pomocí softwarového a hardwarového komplexu PANLAB Harvard Apparatus. Jako hodnotící jednotky byly vybrány diskrétní behaviorální akty zaznamenané pomocí softwarového a hardwarového komplexu.
Studie byla provedena na 30 potkanech (skupina 1, 2 a 3). Před experimentem byla zvířata chována v laboratorním viváriu po 10 jedincích v kleci, s nepřevedeným 12hodinovým režimem, při pokojové teplotě 22-24 °C a vlhkosti 60 %, na standardní stravě. Pokusy byly prováděny v létě. Získané výsledky byly ověřeny na normalitu rozdělení pomocí Shapiro-Wilkova kritéria a zpracovány metodami variační statistiky s využitím Studentova t-testu a počítačového programového balíku STATISTICA. Na obrázku je schematicky znázorněn plán experimentu. Pro hodnocení exploračního chování byla zaznamenávána horizontální aktivita, reakce na grooming, vyhledávací aktivita, lokomoční aktivita, močení a defekace. Experiment byl prováděn v zatemněné místnosti, izolované od vnějšího hluku a slunečního světla, v době od 10 do 14 hodin. Otevřené pole představovalo čtvercovou plochu o rozměrech 150x150 cm se stranami vysokými 30 cm. Teplota v místnosti byla udržována na 23 stupních Celsia. Po každém zvířeti bylo otevřené pole dezinfikováno, aby se odstranil zápach. Před studiem každé skupiny bylo na volné prostranství vypuštěno nulté zvíře.
V 21. den byli potkani z pokusu vyřazeni. Po anestezii potkanů byla na pevné plošině provedena izolace pravé krční tepny, obnažen mediální stehenní sval a katetrizována levá stehenní žíla. Vícesložková studie hemodynamických parametrů byla vyšetřena metodou specializovaných provokačních testů zahrnujících podání acetylcholinu a nitroprusidu sodného (NO) do femorálního katétru. Parametry (systolický krevní tlak, diastolický krevní tlak, srdeční frekvence) byly zaznamenávány pomocí senzoru TDS. Senzor byl instalován nad střední třetinou pravé femorální tepny a byly zaznamenávány následující ukazatele: maximální systolická (VS) a diastolická (VD) rychlost, průměrná (QAs) a objemová (QAM) rychlost krevního toku, pulzační index (PL, Goslingův index) a index odporu (RI, Pourcelotův index). K měření rychlosti krvinek v cévách mikrocirkulačního řečiště byla použita sonda-senzor ve tvaru jehly, která byla umístěna v dolní třetině mediálního širokého stehenního svalu. Vazoaktivní látky (acetylcholin - 40 mcg/kg, nitroprusid sodný - 30 mcg/ kg) byly aplikovány katétrem zavedeným do levé stehenní žíly postupně v intervalu 15 minut. Tím byla zajištěna možnost paralelního sledování hemodynamických a mikrocirkulačních parametrů v třístupňovém systému (centrální cirkulace - elastický cévní systém - periferní cévní systém). Statistické zpracování výsledků bylo provedeno pomocí softwaru STATISTICA 10. Poté byl vypočten koeficient endoteliální dysfunkce (QED). Statistická analýza byla provedena pomocí Spearmanova rankového testu, výpočet spolehlivosti mezi skupinami byl proveden pomocí Studentova parametrického t-testu.
Z předložených grafů vyplývá, že vliv mefedronu na chování zvířat odpovídá jeho hlavním účinkům, které souvisejí s jeho známým mechanismem účinku. Graf 1 tedy ilustruje významné zvýšení horizontální motorické aktivity ve srovnání s kontrolní skupinou. Diagram 2 ukazuje, že se významně snížily úkony spojené s groomingem. Tento jev je způsoben snížením motivačního vlivu s ohledem na aktuální potřebu. Diagram 3 jasně vizualizuje zvýšení úkonů defekace a močení, což je jeden z častých účinků příjmu 4 mmc. Zvýšení horizontální aktivity může znamenat anxiolytické, anxiogenní, agitační účinky nebo zvýšení motorické aktivity bez emoční složky (motorické vzrušení). Groomingové reakce lze také interpretovat nejednoznačně, protože frekvence groomingových aktů se zvyšuje jak ve stresujícím, tak v příznivém prostředí. Nejjednoznačněji lze interpretovat projevy explorační aktivity, stejně jako frekvenci močení a defekace. Pomocí tohoto algoritmu lze dojít k závěru, že farmakodynamický účinek týkající se vyšší nervové aktivity lze interpretovat jako motorické vzrušení s emoční složkou.
Kontrolní skupina vykazovala stejný typ reakcí na zavedení ACH a NO, které se projevily poklesem systolického, diastolického a středního krevního tlaku, snížením lineární rychlosti mikrocirkulace, jakož i diastolické rychlosti pohybu krve ve femorální tepně (dále FA), (datové ukazatele - Vd, Vad); 2) zvýšením systolické rychlosti pohybu krve ve FA (VS, Vas), Purcellova a Goslingova indexu. Tyto parametry se do 2 minut vrátily na původní hodnoty.
Další statistické zpracování bylo provedeno při stanovení počtu hodnot v čase pro každý vzorek, které byly vyjádřeny v procentech. Spearmanovo kritérium, které bylo použito pro statistickou analýzu, ukázalo nejlepší vyjádření potřebného rozdílu statisticky významných parametrů. Největší míra korelace (p<0,05) byla zjištěna mezi indexem středního arteriálního tlaku (dále jen MAD), lineární rychlostí mikrocirkulace, systolickou rychlostí a rozdílem systolicko-diastolické rychlosti ve femorální tepně. Ostatní sonografické parametry vykazovaly nízkou a méně spolehlivou korelaci s dynamikou krevního tlaku a rychlostí mikrocirkulace. Studie perorálně podávaného 4-mmc prokázala statisticky významné zvýšení ukazatelů SAD, DAD a koeficientu endoteliální dysfunkce (QED) ve srovnání s kontrolní skupinou. Ukazatele maximální systolické (VS) a maximální diastolické rychlosti (VD) se při provokačních testech u potkanů skupiny 3, u které byl mefedron podáván perorálně, významně snížily.
Účinnost endotelově závislých relaxačních faktorů uvolněných a aktivovaných podáním acetylcholinu je kvantitativně i kvalitativně snížena. Účinek zprostředkovaný NO v reakci na ACH provokační test se snižuje v důsledku negativního vlivu 4-mmc na produkci a expresi tohoto faktoru i na aktivitu guanylátcyklázy. ACH indukovaná relaxace mikrocirkulačních cév závislá na endotelu, zprostředkovaná muskarinovými receptory, je rovněž narušena v důsledku degenerace aktivity receptorů a také v důsledku snížení hustoty receptorů na povrchu endotelu. Je pravděpodobné, že mechanismus snížení ACH zprostředkované reakce závislé na endotelu v reakci na užívání mefedronu je způsoben výrazným zvýšením tvorby volných radikálů (superoxidových i hydroxylových) v hypoxickém stavu buňky, které interagují s NO2 a NO3.
Došlo ke statisticky významnému snížení metabolické aktivity neutrofilů o 38,4 % (Me = 13,1 s mezikvartilovým rozmezím od 10,3 do 15,9 s rozdílem 5,3 při p=0,002; z = 3,008) ve srovnání s ukazateli kontrolní skupiny. Ve studii absorpční kapacity fagocytózy s přídavkem latexu se ukazatele zvýšily z 13,1 Me na 16,5 Me, přičemž procentuální nárůst u skupiny 3 (intraperitoneální podání) činí 18,2 %, avšak procentuální rozdíl oproti kontrolní skupině je 18,0 %, což je významný a statisticky spolehlivý důkaz imunosupresivního účinku. Rovněž bylo zjištěno statisticky významné snížení spontánní fagocytózy u skupiny 3, která byla snížena o 25,3 % (při p>0,0001, z=2,84) ve srovnání s intaktními zvířaty.
Provedení studie prozánětlivých účinků mefedronu a identifikace jeho etologických vlastností jsou povinnou fází výzkumu 4-MMC, který je považován za jednu z nejoblíbenějších psychoaktivních látek z hlediska rekreačního užívání. Podání, transport a koncentrace mefedronu v jeho cílových tkáních závisí nejen na podané dávce, ale také na řadě dalších faktorů - distribuci látky, stupni a rychlosti absorpce, způsobu metabolismu a vylučování. V průběhu studie je důležité stanovit podíl látky distribuované v cílových tkáních nebo biologických tekutinách, s nimiž je transportována, takže lze zjistit, která část podané látky podléhá biotransformaci a která část se dostává do systémového krevního oběhu v nezměněné podobě. Ve fázi preklinického testování je také kromě studia hlavních mechanismů účinku potřeba provést rozsáhlý fenotypový screening, který je nezbytný pro důkladné pochopení farmakodynamiky a vedlejších účinků látky. Jedním z důležitých aspektů takového screeningu je studium psychoaktivních vlastností látky.
Cíle studie.
1. Stanovit kognitivní motivační a behaviorální vzorce u potkanů, kterým byl podáván 4-methylmethkathinon.
2. Studovat endoteliální funkci prováděním vaskulárních farmakologických testů s využitím blokády NO-syntézy pod ultrazvukovou kontrolou rychlosti krevního průtoku ve femorální tepně potkana a laserovou dopplerovskou flowmetrií monitorující celkovou hemodynamiku a rychlost mikrocirkulace v mediálním svalu.
3. Identifikace a vyhodnocení prozánětlivých a imunoregulačních aktivit 4-methylmetkatinonu pomocí modelu formalinem indukovaného edému tlapky a NBT testu.
Materiály a metody: 1.
Studie byla provedena na 40 samcích potkanů kmene Wistar o hmotnosti 180-200 g. Byly stanoveny 4 skupiny: 1) Kontrolní skupina (intaktní potkani); 2) Potkani, kterým byl podáván mefedron intraperitálně každých 48 hodin v dávce 5 mg/kg rozpuštěné v roztoku NaCl 0,9 (0,5 ml). 3) Potkani, kterým byl mefedron podáván perorálně (přes zkumavku) každých 48 hodin v dávce 5 mg/kg rozpuštěné v roztoku NaCl 0,9 (0,5 ml). 4) Potkani, kterým byl podáván mefedron intraperitoneálně každých 48 hodin v dávce 5 mg/kg rozpuštěné v roztoku NaCl 0,9 (0,5 ml) před podáním formalínu pro model formalínem indukovaného edému tlapky.
Popis studie a diskuse.
Stanovení kognitivních motivačních a behaviorálních vzorců u potkanů, kterým byl podáván 4-methylmethkathinon. Pro dosažení tohoto cíle byly formulovány následující cíle: posoudit vliv 4-methylmethkathinonu na úroveň vzrušení, úzkosti a odolnosti vůči stresu u potkanů. Ke zjištění psychoemocionálního stavu studovaných zvířat jsme použili vylepšený protokol Hallova testu, který spočívá v umístění předmětu do standardizované arény a registraci ukazatelů aktivity pomocí softwarového a hardwarového komplexu PANLAB Harvard Apparatus. Jako hodnotící jednotky byly vybrány diskrétní behaviorální akty zaznamenané pomocí softwarového a hardwarového komplexu.
Studie byla provedena na 30 potkanech (skupina 1, 2 a 3). Před experimentem byla zvířata chována v laboratorním viváriu po 10 jedincích v kleci, s nepřevedeným 12hodinovým režimem, při pokojové teplotě 22-24 °C a vlhkosti 60 %, na standardní stravě. Pokusy byly prováděny v létě. Získané výsledky byly ověřeny na normalitu rozdělení pomocí Shapiro-Wilkova kritéria a zpracovány metodami variační statistiky s využitím Studentova t-testu a počítačového programového balíku STATISTICA. Na obrázku je schematicky znázorněn plán experimentu. Pro hodnocení exploračního chování byla zaznamenávána horizontální aktivita, reakce na grooming, vyhledávací aktivita, lokomoční aktivita, močení a defekace. Experiment byl prováděn v zatemněné místnosti, izolované od vnějšího hluku a slunečního světla, v době od 10 do 14 hodin. Otevřené pole představovalo čtvercovou plochu o rozměrech 150x150 cm se stranami vysokými 30 cm. Teplota v místnosti byla udržována na 23 stupních Celsia. Po každém zvířeti bylo otevřené pole dezinfikováno, aby se odstranil zápach. Před studiem každé skupiny bylo na volné prostranství vypuštěno nulté zvíře.
V 21. den byli potkani z pokusu vyřazeni. Po anestezii potkanů byla na pevné plošině provedena izolace pravé krční tepny, obnažen mediální stehenní sval a katetrizována levá stehenní žíla. Vícesložková studie hemodynamických parametrů byla vyšetřena metodou specializovaných provokačních testů zahrnujících podání acetylcholinu a nitroprusidu sodného (NO) do femorálního katétru. Parametry (systolický krevní tlak, diastolický krevní tlak, srdeční frekvence) byly zaznamenávány pomocí senzoru TDS. Senzor byl instalován nad střední třetinou pravé femorální tepny a byly zaznamenávány následující ukazatele: maximální systolická (VS) a diastolická (VD) rychlost, průměrná (QAs) a objemová (QAM) rychlost krevního toku, pulzační index (PL, Goslingův index) a index odporu (RI, Pourcelotův index). K měření rychlosti krvinek v cévách mikrocirkulačního řečiště byla použita sonda-senzor ve tvaru jehly, která byla umístěna v dolní třetině mediálního širokého stehenního svalu. Vazoaktivní látky (acetylcholin - 40 mcg/kg, nitroprusid sodný - 30 mcg/ kg) byly aplikovány katétrem zavedeným do levé stehenní žíly postupně v intervalu 15 minut. Tím byla zajištěna možnost paralelního sledování hemodynamických a mikrocirkulačních parametrů v třístupňovém systému (centrální cirkulace - elastický cévní systém - periferní cévní systém). Statistické zpracování výsledků bylo provedeno pomocí softwaru STATISTICA 10. Poté byl vypočten koeficient endoteliální dysfunkce (QED). Statistická analýza byla provedena pomocí Spearmanova rankového testu, výpočet spolehlivosti mezi skupinami byl proveden pomocí Studentova parametrického t-testu.
Z předložených grafů vyplývá, že vliv mefedronu na chování zvířat odpovídá jeho hlavním účinkům, které souvisejí s jeho známým mechanismem účinku. Graf 1 tedy ilustruje významné zvýšení horizontální motorické aktivity ve srovnání s kontrolní skupinou. Diagram 2 ukazuje, že se významně snížily úkony spojené s groomingem. Tento jev je způsoben snížením motivačního vlivu s ohledem na aktuální potřebu. Diagram 3 jasně vizualizuje zvýšení úkonů defekace a močení, což je jeden z častých účinků příjmu 4 mmc. Zvýšení horizontální aktivity může znamenat anxiolytické, anxiogenní, agitační účinky nebo zvýšení motorické aktivity bez emoční složky (motorické vzrušení). Groomingové reakce lze také interpretovat nejednoznačně, protože frekvence groomingových aktů se zvyšuje jak ve stresujícím, tak v příznivém prostředí. Nejjednoznačněji lze interpretovat projevy explorační aktivity, stejně jako frekvenci močení a defekace. Pomocí tohoto algoritmu lze dojít k závěru, že farmakodynamický účinek týkající se vyšší nervové aktivity lze interpretovat jako motorické vzrušení s emoční složkou.
Kontrolní skupina vykazovala stejný typ reakcí na zavedení ACH a NO, které se projevily poklesem systolického, diastolického a středního krevního tlaku, snížením lineární rychlosti mikrocirkulace, jakož i diastolické rychlosti pohybu krve ve femorální tepně (dále FA), (datové ukazatele - Vd, Vad); 2) zvýšením systolické rychlosti pohybu krve ve FA (VS, Vas), Purcellova a Goslingova indexu. Tyto parametry se do 2 minut vrátily na původní hodnoty.
Další statistické zpracování bylo provedeno při stanovení počtu hodnot v čase pro každý vzorek, které byly vyjádřeny v procentech. Spearmanovo kritérium, které bylo použito pro statistickou analýzu, ukázalo nejlepší vyjádření potřebného rozdílu statisticky významných parametrů. Největší míra korelace (p<0,05) byla zjištěna mezi indexem středního arteriálního tlaku (dále jen MAD), lineární rychlostí mikrocirkulace, systolickou rychlostí a rozdílem systolicko-diastolické rychlosti ve femorální tepně. Ostatní sonografické parametry vykazovaly nízkou a méně spolehlivou korelaci s dynamikou krevního tlaku a rychlostí mikrocirkulace. Studie perorálně podávaného 4-mmc prokázala statisticky významné zvýšení ukazatelů SAD, DAD a koeficientu endoteliální dysfunkce (QED) ve srovnání s kontrolní skupinou. Ukazatele maximální systolické (VS) a maximální diastolické rychlosti (VD) se při provokačních testech u potkanů skupiny 3, u které byl mefedron podáván perorálně, významně snížily.
Účinnost endotelově závislých relaxačních faktorů uvolněných a aktivovaných podáním acetylcholinu je kvantitativně i kvalitativně snížena. Účinek zprostředkovaný NO v reakci na ACH provokační test se snižuje v důsledku negativního vlivu 4-mmc na produkci a expresi tohoto faktoru i na aktivitu guanylátcyklázy. ACH indukovaná relaxace mikrocirkulačních cév závislá na endotelu, zprostředkovaná muskarinovými receptory, je rovněž narušena v důsledku degenerace aktivity receptorů a také v důsledku snížení hustoty receptorů na povrchu endotelu. Je pravděpodobné, že mechanismus snížení ACH zprostředkované reakce závislé na endotelu v reakci na užívání mefedronu je způsoben výrazným zvýšením tvorby volných radikálů (superoxidových i hydroxylových) v hypoxickém stavu buňky, které interagují s NO2 a NO3.
Došlo ke statisticky významnému snížení metabolické aktivity neutrofilů o 38,4 % (Me = 13,1 s mezikvartilovým rozmezím od 10,3 do 15,9 s rozdílem 5,3 při p=0,002; z = 3,008) ve srovnání s ukazateli kontrolní skupiny. Ve studii absorpční kapacity fagocytózy s přídavkem latexu se ukazatele zvýšily z 13,1 Me na 16,5 Me, přičemž procentuální nárůst u skupiny 3 (intraperitoneální podání) činí 18,2 %, avšak procentuální rozdíl oproti kontrolní skupině je 18,0 %, což je významný a statisticky spolehlivý důkaz imunosupresivního účinku. Rovněž bylo zjištěno statisticky významné snížení spontánní fagocytózy u skupiny 3, která byla snížena o 25,3 % (při p>0,0001, z=2,84) ve srovnání s intaktními zvířaty.
- Při podávání mefedronu pokusným zvířatům byla zaznamenána statisticky významná změna v analyzovaných behaviorálních aktech. Tato skutečnost naznačuje přítomnost specifické psychotropní aktivity této sloučeniny spojené s nadměrně zvýšenou hladinou vzrušení a úzkosti, avšak se sníženou odolností vůči stresu. Výsledky studie tak v této fázi rozšířily informace o profilu působení této sloučeniny. Pozorované psychotropní účinky 4-mmc prohlubují poznání jeho farmakologické aktivity a měly by být předmětem dalšího studia.
- Přetrvávající zvýšené parametry krevního tlaku v počátečních stavech potkanů skupiny 3 (mefedron), stejně jako jejich relativní ukazatele po provokačních testech, jsou způsobeny narušením nejen exprese NO (jednoho z hlavních vazodilatačních faktorů regulujících činnost mikrocirkulačních cév), ale také prostacyklinů a endoteliálních hyperpolarizačních faktorů (EDHF). Výsledky studie v této fázi potvrdily teoretický předpoklad o nadměrném negativním účinku mefedronu jak na endotel mikrocirkulačních cév, tak na životaschopnost kardiovaskulárního systému jako celku. Získané údaje lze využít při plánování preklinických studií k rozšíření spektra komplikací spojených s užíváním 4-mmc a také k sestavení algoritmu klinických doporučení pro farmakologickou korekci těchto komplikovaných stavů.
- Vezmeme-li v úvahu, že mefedron pravděpodobně snižuje perfuzní propustnost buněčné stěny a transportní funkci proteinů, ovlivňuje pasivní i facilitovanou difuzi a aktivní transport, určitým způsobem ovlivňuje kognitivní vzorce (včetně opožděných fenoménů) a má také schopnost pozitivně ovlivnit koagulační složku hemostázy (hyperkoagulace), lze předpokládat, že převažuje aktivita COX-2 jako hlavního enzymu hrajícího roli v indukci alternativní fáze zánětu. Použití selektivních inhibitorů COX-2 k léčbě zánětlivých onemocnění u pacientů užívajících 4-mmc je tedy nejvýhodnější a opodstatněné. Pro přesnou definici farmakologické léčby zaměřené na zmírnění zánětlivých procesů spojených s užíváním 4-mmc jsou však nutné další preklinické studie.
- Výsledky ve třetí fázi studie prokázaly snížení metabolické a absorpční aktivity neutrofilů u potkanů patřících do skupiny 3 (intraperitoneální podání 4-mmc) ve srovnání s ukazateli zvířat z kontrolní skupiny. To definuje mefedron jako látku, která má imunosupresivní účinek. Tento závěr je základem pro další studie patogenetické korektivní imunoterapie.
Last edited by a moderator: